Wararka

Waad ku mahadsan tahay booqashada Nature.com.Nooca browserka aad isticmaalayso waxa uu leeyahay taageerada CSS oo xadidan.Waayo-aragnimada ugu fiican, waxaan kugula talineynaa inaad isticmaasho browser-ka la cusboonaysiiyay (ama aad damiso Habka Laqabsiga ee Internet Explorer).Dhanka kale, si loo xaqiijiyo taageerada joogtada ah, waxaan ka dhigi doonaa goobta iyada oo aan lahayn qaabab iyo JavaScript.
Hababka calaamadaynta u dhowaanshaha enzymatic ee ku salaysan esters firfircoon ama radicals phenoxy ayaa si weyn loo isticmaalaa in lagu sawiro borotiinka unugyada hoose iyo isdhexgalka borotiinka ee unugyada nool.Si kastaba ha noqotee, esters-ka firfircooni way yar yihiin fal-celin yar, taasoo keentay calaamadeyn ballaaran, iyo radicals phenoxy oo ay abuurtay daaweynta peroxide waxay faragelin kartaa waddooyinka dib-u-celinta.Halkan waxaanu kaga warbixinaynaa habka sawir-qaadista ku-tiirsanaanta ku-tiirsanaanta (PDPL) ee lagu sameeyay iyadoo hidde ahaan loogu xidhay borotiinka sawir-qaadista miniSOG iyo borotiinka xiisaha.Waxaa kiciyay iftiinka buluuga ah oo ay maamusho wakhtiga soo-gaadhista, ogsijiinta hal-abuurka ah ayaa la soo saarayaa ka dibna si aan caadi ahayn loo xalliyo calaamadaynta hadhaaga histidine ee baaritaanka aniline waa la gaaray.Waxaan ku muujinnaa daacadnimadeeda sare anagoo adeegsanayna khariidadeynta proteome-ka ee organelle.Isbarbardhigga dhinac-dhinac ee PDPL iyo TurboID waxay tusinaysaa caynsanaanta borotokoolka ee PDPL aad u gaar ah oo dhammaystiran.Marka xigta, waxaan ka codsanay PDPL coactivator transcriptional coactivator BRD4 iyo E3 Parkin ligase oo aan helnay is dhexgalyaal aan hore loo aqoon.Baadhitaanka xad-dhaafka ah, laba substrates oo aan la garanayn, Ssu72 iyo SNW1, ayaa loo aqoonsaday Parkin, kaas oo hoos u dhaciisa lagu dhexdhexaadiyo dariiqa-proteasome-ka-ganacsiga.
Tilmaamida saxda ah ee shabakadaha borotiinka ayaa hoosta ka xariiqaya habab badan oo aasaasi ah oo unuggu.Sidaa darteed, khariidaynta isdhexgalka borotiinka ee saxda ah ee saxda ah waxay bixin doontaa saldhig unugyo ah oo lagu kala saaro dariiqyada bayoolojiga, cudurada cudurada, iyo carqaladaynta isdhexgalkaan ujeedooyinka daawaynta.Si taas loo gaaro, hababka awood u leh in lagu ogaado isdhexgalka ku meel gaarka ah ee unugyada nool ama unugyada ayaa ah mid aad loo jecel yahay.Sifeynta Mass Spectrometry (AP-MS) ayaa taariikh ahaan loo isticmaalay in lagu aqoonsado shuraakada isku xidha borotiinnada xiisaha (POI).Iyada oo la horumarinayo hababka proteomics tiro, Bioplex3.0 ayaa la sameeyay, xogta ugu weyn ee shabakadaha borotiinka ee ku salaysan AP-MS.In kasta oo AP-MS ay aad u awood badan tahay, lysis-ka unugyada iyo tillaabooyinka milanka ee socodka shaqadu waxay u janjeeraan dhanka daciifnimada iyo isdhexgalka ku-meel-gaadhka ah waxayna soo bandhigaan artifacts post-lysis sida lammaane is-dhexgal qarsoodi ah oo aan lahayn qayb-qaybin ka hor lysis.
Si arrimahan wax looga qabto, amino acids (UAA) oo aan dabiici ahayn oo leh kooxo isku xidha iyo calaamadaynta enzymatic ee u dhow (PL) waa la sameeyay (tusaale APEX iyo BioID)5.Inkasta oo habka UAA si guul leh loogu dabaqay xaalado badan oo uu ku bixiyo macluumaadka ku saabsan xabagta borotiinka tooska ah, hagaajinta goobta gelinta UAA ayaa weli loo baahan yahay.Waxa ka sii muhiimsan, waa habka calaamadaynta stoichiometric ee ka maqan dib-u-noqoshada calaamadaynta dhacdooyinka.Taas bedelkeeda, hababka enzymatic PL, sida habka BioID, waxay ku dhejiyaan biotin ligase ee loo yaqaan 'POI7', kaas oo markaa ka dib kicinaya biotin si uu u sameeyo dhexdhexaad biotinyl-AMP ester dhexdhexaad ah.Insaymku sidaas ayuu u kiciyaa oo sii daayaa biotin “daruur” firfircoon oo calaamadisa hadhaaga lysine ee u dhow.Si kastaba ha ahaatee, BioID waxay u baahan tahay in ka badan 12 saacadood si loo helo calaamad ku filan oo calaamadeysan, taas oo ka hortagaysa isticmaalkeeda xallinta ku meel gaarka ah.Isticmaalka kobaca la toosay ee ku salaysan bandhiga khamiirka, TurboID waxaa loo qaabeeyey iyadoo lagu salaynayo BioID si ay u noqoto mid wax ku ool ah, taasoo u oggolaanaysa in si hufan loogu calaamadiyo biotin 10 daqiiqo gudahood, taasoo u oggolaanaysa habab firfircoon oo dheeraad ah in la barto.Sababtoo ah TurboID aad ayuu u firfircoon yahay oo heerarka biotin-ka endogenous ayaa ku filan calaamadaynta heerka hoose, calaamadaynta asalka waxay noqotaa dhibaato iman karta marka si weyn loo wanaajiyo oo calaamadaynta waqtigeeda loo baahan yahay iyada oo lagu daro biotin dibadda ah.Intaa waxaa dheer, esters-ka firfircoon ayaa si liidata u falceliya (t1 / 2 ~ 5 min), taas oo u horseedi karta calaamad weyn oo calaamad ah, gaar ahaan ka dib marka la isku daro borotiinnada deriska ah ee biotin 5. Hab kale, isku-dhafka hidde-socodka ee ascorbate peroxidase (ie biotin- phenol radicals waxayna ogolaataa calaamadaynta borotiinka hal daqiiqo gudaheed9,10.APEX waxaa si weyn loo isticmaalaa in lagu aqoonsado proteomes-ka hoose, unugyada borotiinka xuubabka, iyo borotiinka calaamadaha cytosolic11,12. hababka gacanta.
Haddaba, hab cusub oo awood u leh in uu dhaliyo noocyada xakamaynta shucaaca-radius oo firfircoon oo leh saxnaan sare oo meel iyo waqti ku meel gaar ah iyada oo aan si weyn loo carqaladayn dariiqyada gacanta waxa ay noqon doontaa mid muhiim u ah hababka jira. Noocyada falceliska ah waxaa ka mid ah, oksijiinta kelida ah ayaa dareenkeena kicisay iyadoo ay ugu wacan tahay cimrigiisa gaaban iyo raadiyaha faafinta xaddidan (t1/2 <0.6 µs ee unugyada)13. Noocyada falceliska ah waxaa ka mid ah, oksijiinta kelida ah ayaa dareenkeena kicisay iyadoo ay ugu wacan tahay cimrigiisa gaaban iyo raadiyaha faafinta xaddidan (t1/2 <0.6 µs ee unugyada)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Noocyada firfircoon waxaa ka mid ah, oksijiinta kelida ah ayaa soo jiidatay dareenkayaga sababtoo ah cimrigeeda gaaban iyo xajmiga fidinta xaddidan (t1/2 <0.6 µs ee unugyada)13.. 1/2 <0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Noocyada firfircoon waxaa ka mid ah, ogsijiinta kelida ah ayaa soo jiidata dareenkayaga sababtoo ah cimrigeeda gaaban iyo radius faafinta xaddidan (t1/2 <0.6 μs ee unugyada).Ogsajiinta kali ah ayaa lagu soo warramey inay si aan kala sooc lahayn u oksaydhisay methionine, tyrosine, histidine iyo tryptophan, taas oo ka dhigaysa polar 14,15 ee ku xidhan amine ama thiol ku salaysan probes16,17.In kasta oo ogsijiinta kelida ah loo isticmaalay in lagu calaamadiyo qaybta unugyada hoose ee RNA, xeeladaha dib-u-soo-celinta calaamadaha u dhowaanshaha POI ayaa ah mid aan la sahamin.Halkan, waxaan ku soo bandhigaynaa madal lagu magacaabo sawir-qaadista-ku-tiirsanaanta u-dhowaanshaha (PDPL), halkaas oo aan u isticmaalno iftiin buluug ah si aan u iftiimino POIs oo ku dhex jira miniSOG sawir-qaade oo kicinaya jiilka oksijiinta hal-abuurka ah si ay u oksijiyeen hadhaaga u dhow, oo ay ku xigto wax ka beddelka amine-ka kooban si loo oksijiyo baaritaanka kiimikada unugyada noolaha dhexe..Waxaan tijaabinay koox baaritaan kiimikaad ah si aan sare ugu qaadno sumadda gaarka ah iyo goobaha wax ka beddelka ee la aqoonsaday anagoo adeegsanayna socodka shaqada boroteomics-ka.Isbarbardhigga dhinac-dhinac ee PDPL iyo TurboID waxay tusinaysaa caynsanaanta borotokoolka ee PDPL aad u gaar ah oo dhammaystiran.Waxaan u adeegsanay habkan calaamadaha gaarka ah ee organelle ee proteome-ka hoose iyo aqoonsiga guud ee borotiinka ee la-hawlgalayaasha isku xira ee borotiinka sharciyeynta epigenetic ee la xiriira kansarka BRD4 iyo cudurka Parkinson ee la xiriira E3 ligase Parkin, kaas oo xaqiijiyay labadaba shabakad la yaqaan iyo mid aan la garanayn oo borotiin ah. isdhexgalka..Kartida PDPL si ay u aqoonsato substrate-yada E3 ee dhismooyinka borotiinka waaweyn waxay ka dhigan tahay xaalad aqoonsiga xirmooyinka aan tooska ahayn loo baahan yahay.Laba substrates oo baarkin ah oo aan la garanayn oo ay dhexdhexaadiyeen ubiquitination-proteasome ayaa lagu xaqiijiyay goobta.
Daawaynta Photodynamic (PDT)19 iyo koromophore-caawin la'aanta leysarka (CALI)20, kaas oo shucaaca iftiinka leh sawir-qaadayaasha ay dhaliyaan ogsijiinta hal-abuurka ah, waxay kicin karaan borotiinnada bartilmaameedka ama waxay sababi karaan dhimashada unugyada.Mar haddii ogsijiinta kelida ahi ay tahay walax aad u firfircoon oo leh fogaan fidineed oo ku saabsan 70 nm, oksaydhaynta xaddidan ee agagaarka sawir-qaade waa la xakameyn karaa.Iyada oo ku saleysan fikraddan, waxaan go'aansanay inaan isticmaalno ogsijiin keli ah si aan u gaarno summad dhow ee isku-dhafka borotiinka ee unugyada nool.Waxaan sameynay habka kiimikaad ee PDPL si loo fuliyo afar hawlood: (1) si loo kiciyo jiilka ogsijiinta hal-abuurka ah ee firfircoon oo la mid ah habka enzymatic PL;(2) in ay bixiyaan sumad waqti-xalin ah oo ku saabsan bilawga iftiinka;(3) beddelka (4) Iska ilaali isticmaalka cofactors endogenous (sida biotin) si aad u yarayso asalka, ama isticmaal reagens qalaad oo aad u qallafsan (sida peroxides) si aad u yarayso soo-gaadhista unugga ee walaaca deegaanka.
Dareen-qaadeyaasha waxa loo qaybin karaa laba qaybood oo ay ku jiraan fluorophores-yar oo miisaan-molecular ah (tusaale rose bengal, methylene blue)22 iyo borotiinada yaryar ee hidde ahaan loo qoondeeyey (tusaale miniSOG, KillerRed)23.Si aan u gaarno nakhshad qaabaysan, waxaanu samaynay jiilkii kowaad ee PDPL anagoo ku darayna borotiinada sawir-qaadista (PS) POI24,25 (Jaantuska 1a).Marka lagu iftiimiyo iftiinka buluuga ah, oksijiinta hal-abuurka ah waxay oxidizes ku dhawaad ​​​​hadhaaga amino acid nucleophilic, taasoo keentay polarity soo jiidasho leh oo elektrofile ah oo ka falcelin kara amine probe nucleophiles16,17.Baadhitaanka waxaa loogu talagalay gacan-qabsiga alkyne si loogu oggolaado gujinta kimistariga oo hoos loogu dhigo sifada LC/MS/MS.
Sharaxaada qaabaysan ee calaamadinta isku dhafka borotiinka oo ay dhexdhexaadisay miniSOG.Marka la soo bandhigo iftiinka buluuga ah, unugyada muujinaya miniSOG-POI waxay soo saaraan ogsijiin keli ah, taas oo wax ka beddeleysa borotiinnada isdhexgalka laakiin aan ahayn borotiinada aan xirneyn.Badeecadaha dhexdhexaadka ah ee photooxidation waxaa dhexda u gala summada gudbinta ee baaritaanka kiimikaad ee aminka si ay u sameeyaan ducooyin isku dhafan.Kooxda alkynyl ee baadhista kimistarigu waxay ogolaataa kimistari guji si loo tayeeyo iyada oo la jiid-jiidinayo oo ay raacayso tirada LC-MS/MS.b Qaabdhismeedka kiimikaad ee baarayaasha amiinada 1-4.c Falanqaynta jel fluorescent wakiilka ee mitochondrial maxaliga ah ee miniSOG-dhexdhexaadinta calaamadaha borotokoolka iyadoo la adeegsanayo baaritaanada 1-4 iyo qiyaasida qaraabada ee ku salaysan densitometry gel.Saamiga calaamad-ilaa-saldhigga ee baadhitaannada kiimikaad ayaa la qiimeeyay iyadoo la adeegsanayo tijaabooyinka xakamaynta taban ee laga reebo iftiinka buluuga ah ama la isticmaalayo unugyada HEK293T iyada oo aan lahayn muujinta miniSOG.n = 2 muunado madax-bannaan oo nafley ah.Dhibic kastaa waxay u taagan tahay nuqul bayooloji ah.d Ogaanshaha iyo qiyaasida matale ee PDPL iyadoo la isticmaalayo baadhitaan la hagaajiyay 3 iyadoo ay joogaan ama maqan yihiin qaybaha PDPL ee la tilmaamay sida c.n = 3 muunado nafley ah oo madaxbannaan.Dhibic kastaa waxay u taagan tahay nuqul bayooloji ah.Xariiqyada dhexe iyo shabaqlaha waxay u taagan yihiin celceliska iyo ± weecanka caadiga ah.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Sawirka Confocal ee ogsijiinta kelida ah ee leh wasakhda Si-DMA-cas ee fog.Cabirka: 10 µmSawir-qaadista jel-ka iyo tijaabooyinka indho-sarcaadka ah ayaa si madax-bannaan loogu soo celiyay ugu yaraan laba jeer natiijooyin isku mid ah.
Waxaan markii hore tijaabinay awoodda sawir-qaadayaasha qaan-gaarka ah miniSOG26 iyo KillerRed23, oo si adag loogu muujiyey HEK293T, si loo dhexdhexaadiyo calaamadaynta borotiinka sida baaritaanka kiimikaad (Jaantuska Dheeraadka ah 1a).Falanqaynta gelitaanka fluorescence waxay muujisay in calaamadaynta borotiinka oo dhan lagu gaadhay iyada oo la adeegsanayo miniSOG iyo shucaaca buluuga ah, iyada oo aan wax calaamad ah oo muuqda lagu arkay KillerRed.Si aan u wanaajino saamiga isha-ilaa-background, waxaanu markaa tijaabinay baadhisyo kiimiko ah oo ka kooban aniline (1 iyo 3), propylamine (2), ama benzylamine (4).Waxaan ogaanay in unugyada HEK293T laftoodu ay leeyihiin calaamad sare oo asal ah marka loo eego iftiin buluug ah, laga yaabo inay sabab u tahay riboflavin photosensitizer endogenous, flavin mononucleotide (FMN) 27. Baadhitaanada kiimikooyinka ku saleysan Aniline 1 iyo 3 waxay siiyeen qeexitaan ka sii wanaagsan, iyadoo HEK293T ay si adag u muujineyso miniSOG ee mitochondria oo muujineysa> 8-laab kororka calaamadaha baaritaanka 3, halka baaritaanka 2 loo adeegsaday habka calaamadeynta RNA-CAP-seq kaliya oo muujinaya ~ 2.5- kor u kaca calaamada laablaabka, oo ay u badan tahay inay sabab u tahay doorbidyada falcelinta kala duwan ee u dhexeeya RNA iyo borotiinka (Jaantus. 1b, c). Baadhitaanada kiimikooyinka ku saleysan Aniline 1 iyo 3 waxay siiyeen qeexitaan ka sii wanaagsan, iyadoo HEK293T ay si adag u muujineyso miniSOG ee mitochondria oo muujineysa> 8-laab kororka calaamadaha baaritaanka 3, halka baaritaanka 2 loo adeegsaday habka calaamadeynta RNA-CAP-seq kaliya oo muujinaya ~ 2.5- kor u kaca calaamada laablaabka, oo ay u badan tahay inay sabab u tahay doorbidyada falcelinta kala duwan ee u dhexeeya RNA iyo borotiinka (Jaantus. 1b, c).Baadhitaanada kiimikooyinka ku salaysan Aniline ee 1 iyo 3 waxay muujiyeen qeexitaan ka sii wanaagsan: HEK293T, oo si adag u muujisa miniSOG ee mitochondria, waxay muujinaysaa in ka badan 8-laab kororka calaamadaha baaritaanka 3, halka baaritaanka 2, loo isticmaalo habka calaamadaynta CAP-seq RNA, kaliya waxay muujinaysaa ~ 2.5-laab kororka calaamadda, laga yaabee inay sabab u tahay doorbidyada falcelinta kala duwan ee u dhexeeya RNA iyo borotiinka (Jaantus. 1b, c).基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-seq 的探针2 仅显示~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNABaadhitaanada kiimikada ku salaysan Aniline 1 iyo 3 ayaa lahaansho gaar ah, HEK293T waxay si adag u muujisay miniSOG ee mitochondria, baaritaanka 3 wuxuu lahaa in ka badan 8-laab kororka calaamadaha, halka baaritaanka 2 ee habka calaamadaynta CAP-seq RNA uu muujiyay kaliya ~ 2.5 -kordhin.ee calaamadda, malaha ay sabab u tahay kala door bidaxeed falcelin oo u dhexeeya RNA iyo borotiinka (Jaantus. 1b, c).Intaa waxaa dheer, baaritaanka 3 isomers iyo hydrazine probes (probes 5, 6, 7) ayaa la tijaabiyey, taasoo xaqiijinaysa hagaajinta baaritaanka 3 (Jaantuska Dheeraadka ah. 1b, c).Sidoo kale, falanqaynta in-gel fluorescence ayaa shaaca ka qaaday xuduudaha kale ee la hagaajiyay ee tijaabada ah: dhererka hirarka iftiinka (460 nm), feejignaanta baaritaanka kiimikada (1 mM), iyo wakhtiga iftiinka (20 min) (Jaantuska Dheeraadka ah 2a-c).Ka tagista wax kasta oo ka mid ah qayb ama tallaabo kasta oo ka mid ah borotokoolka PDPL waxay keentay calaamad muujinaysa dib u noqoshada asalka (Jaantus. 1d).Waxaa xusid mudan, calaamadaynta borotiinka si weyn ayaa loo dhimay iyadoo ay jirto sodium azide ama trolox, kuwaas oo loo yaqaan inay demiyaan ogsijiinta kelida ah.Joogitaanka D2O, kaas oo loo yaqaan inuu dejiyo oksijiinta kelida ah, waxay wanaajisaa calaamadda calaamadaynta.Si loo baadho ka qayb qaadashada noocyada kale ee ogsijiinta fal-celinta ee calaamadaynta, mannitol iyo fitamiin C ayaa lagu daray si loo dhiso hydroxyl iyo superoxide scavengers, siday u kala horreeyaan, 18, 29, laakiin lama helin inay yareeyaan calaamadaynta.Ku darida H2O2, laakiin aan iftiimin, ma keenin calaamadaynta (Jaantuska Dheeraadka ah. 3a).Fluorescence hal-abuurka ogsijiinta hal-abuurka leh ee Si-DMA ayaa xaqiijiyay jiritaanka ogsijiinta hal-abuurka ah ee siliga HEK293T-miniSOG, laakiin kuma jiro siligga asalka ah ee HEK293T.Intaa waxaa dheer, mitoSOX Red ma ogaan karto wax soo saarka superoxide ka dib iftiiminta (Jaantus. 1e iyo Sawirka Dheeraadka 3b) 30. Xogtaasi waxay si adag u soo jeedinaysaa in ogsijiinta kelida ahi ay tahay noocyada ogsijiinta falcelinta ee ugu muhiimsan ee masuulka ka ah calaamadaynta borotiinka ee xiga.Cytotoxicity ee PDPL ayaa la qiimeeyay oo ay ku jiraan shucaaca iftiinka buluuga ah iyo kiimikooyinka kiimikaad, mana jirin cytotoxicity muhiim ah oo la arkay (Jaantuska Dheeraadka ah 4a).
Si aan u barano habka calaamadaynta oo aan awood u siinno aqoonsiga borotiinka ee dhismooyinka borotiinka iyadoo la adeegsanayo LC-MS/MS, waxaan marka hore u baahannahay inaan go'aamino asiidhyada amino-ka ee wax laga beddelay iyo tirada delta ee calaamadaha baaritaanka.Methionine, histidine, tryptophan iyo tyrosine ayaa la sheegay in lagu bedelay oksijiin kali ah14,15.Waxaan ku dhex darnaa socodka shaqada TOP-ABPP31 raadinta furan eex la'aanta ah oo ay bixiso FragPipe kombuyuutar ku salaysan MSFragger32.Beddelka oksijiinta kelida ah iyo calaamadaynta kiimikaad ka dib, kimistari gujis ayaa la sameeyay iyada oo la adeegsanayo summada dhimista biotin ka oo ay ku jirto isku xidhaha la kala furfuri karo, oo ay ku xigto kala bixinta neutravidin iyo dheefshiidka trypsin.peptide-ka la bedelay, ee wali ku xidhan xabagta, ayaa sawir laga qaaday si loo baaro LC-MS/MS (Jaantuska 2a iyo Xogta Dheeraadka ah 1).Tiro badan oo wax ka beddel ah ayaa ka dhacay dhammaan proteome-ka oo leh in ka badan 50 khariidad peptide (PSM) oo taxan (Jaantus 2b).Waxa la yaab leh, waxaanu kaliya aragnay wax ka beddelka histidine, malaha sababtoo ah falcelinta sare ee histidine oksaydhka ah ee ku wajahan baadhitaanada aniline marka loo eego amino acids kale.Marka loo eego habka la daabacay ee oxidation histidine by singlet oxygen,21,33 qaabdhismeedka delta-mass ee la soo jeediyay ee +229 Da waxay u dhigantaa baaritaanka 3 ee leh 2-oxo-histidine ka dib laba oksaydhyo, halka +247 Da ay tahay sheyga hydrolysis ee +229 Da (Jaantuska Dheeraadka ah. 5).Qiimaynta MS2 spectrum waxay muujisay isku halaynta sare ee aqoonsiga inta badan y iyo b ions, oo ay ku jirto aqoonsiga jajabka jajaban ee la bedelay (y iyo b) (Jaantus. 2c).Falanqaynta macnaha guud ee taxanaha maxalliga ah ee PDPL-la beddelay histidines ayaa shaaca ka qaaday doorbidid dhexdhexaad ah oo loogu talagalay hadhaaga hydrophobic yar ee boosaska ± 1 (Jaantuska Dheeraadka ah. 4b).Celcelis ahaan, 1.4 histidines ayaa lagu aqoonsaday borotiinkiiba, goobaha calamadahan waxaa lagu go'aamiyay aagga sare ee la heli karo (SASA) iyo helitaanka dareeraha qaraabada ah (RSA) falanqaynta (Jaantuska Dheeraadka ah. 4c,d).
Socod shaqo oo aan eex lahayn oo lagu baranayo xulashada hadhaaga iyadoo la adeegsanayo mashiinka xisaabinta FragPipe ee ay ku shaqeyso MSFragger.Xidhiidhiyayaasha la jeexjeexi karo ayaa loo isticmaalaa kimistariga Riix si ay u oggolaadaan in la nadiifiyo peptides-ka la beddelay ee resin streptavidin.Baadhitaan furan ayaa la bilaabay si loo ogaado isbeddello badan, iyo sidoo kale hadhaaga khuseeya.b U qoondee tirada badan ee wax ka beddelka ee ka dhacaya borotiinka oo dhan.Khariidaynta Peptide ee PSM.c MS2 spectral annotation of histidine sites oo lagu beddelay baadhitaan 3. Tusaale ahaan, falcelin isku xidhan oo leh baadhitaan 3 ayaa +229.0938 Da ku daray amino acid-ka la beddelay.d Qiimaynta isu beddelka ee loo isticmaalo in lagu tijaabiyo calaamadaha PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) iyo PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ayaa lagu shubay plasmids nooca duurjoogta ah si loo ogaado calanka lidka ku ah.e peptide-ka synthetic waxaa lagu falceliyay miniSOG oo la safeeyey iyadoo ay joogaan baaritaanka 3 iyo alaabada u dhiganta Δm +247 iyo +229 ayaa lagu xusay spectrum LC-MS.f Isdhexgalka borotiinka-ilaa-barootiinka ee loo qaabeeyey miniSOG-6xHis-tag iyo anti-6xAntibody.Antibiotin (streptavidin-HRP) iyo falanqeynta ka hortagga mouse-ka ee Western blot ee miniSOG-6xHis/anti-6xXirsyada difaaca jirka ee lagu calaamadeeyay baaritaanka 3, iyadoo ku xiran waqtiga iftiinka.Calaamadaha borotiinnada shaqsiga ah waxaa lagu muujiyey miisaanka unugyadu ee u dhigma: silsiladda iftiinka LC antibody, silsilad culus oo ka hortagta HC.Tijaabooyinkan ayaa si madax-banaan lagu soo celceliyay ugu yaraan laba jeer natiijooyin isku mid ah.
Xaqiijinta biochemical ee goobta calaamadaynta, PRDX3 iyo PRDX1 ee lagu aqoonsaday spectrometry mass ayaa laga beddelay histidine oo loo beddelay alanine marka la barbar dhigo nooca duurjoogta ah ee baaritaanka gudbinta.Natiijooyinka PDPL waxay muujiyeen in isbeddelku si weyn hoos ugu dhigay calaamadaynta (Jaantus. 2d).Dhanka kale, isku xigxiga peptide ee lagu aqoonsaday raadinta furan ayaa la sameeyay oo lagu falceliyay vitro oo leh miniSOG oo la safeeyey iyadoo ay joogaan baaritaanka 3 iyo iftiinka buluuga ah, soo saarista alaabooyinka leh isbeddel ballaaran oo +247 iyo + 229 Da marka la ogaado LC-MS (Sawir) .2e).).Si loo tijaabiyo in borotiinnada u dhow ee isdhexgalka lagu calaamadin karo gudaha vitro iyada oo laga jawaabayo miniSOG photoactivation, waxaan u qaabeynay qiimeyn ku dhowaanshaha macmal ah iyadoo la isdhexgalka ka dhexeeyo miniSOG-6xBarootiinkiisa iyo antibody-kiisa monoclonal antibody in vitro (Jaantuska 2f).Qiimayntan, waxaanu filaynay summaynta u dhow ee silsilado culus iyo kuwo fudud oo ka hortag ah oo wata miniSOG.Dhab ahaantii, anti-jiirka (aqoonsiga silsiladaha culus iyo kuwa fudud ee anti-6xHis-labeled antibody) iyo streptavidin Western blots waxay muujiyeen biotinylation xooggan ee silsiladaha culus iyo kuwa fudud.Si gaar ah, waxaan ogaanay miniSOG autobiotinylation sababtoo ah 6xHis tag iyo isku xirka u dhexeeya silsiladaha iftiinka iyo culus, kuwaas oo laga yaabo inay la xiriiraan farqiga hore ee u dhexeeya lysine iyo 2-oxo-histidine proximal.Gebogebadii, waxaan ku soo gabagabeyneynaa in PDPL ay wax ka beddesho histidine hab ku tiirsan dhow.
Hadafkayagii xigay waxa uu ahaa in aan tilmaamno proteome-ka-hoosaadka si loo tijaabiyo gaar ahaan calaamadaynta goobta.Sidaa darteed, waxaan si adag u muujinay miniSOG ee xudunta, mitochondrial matrix, ama xuubka ER ee unugyada HEK293T (Jaantus. 3a).Falanqaynta faylalka gelitaanka ayaa daaha ka qaaday kooxo calaamadaysan oo badan oo ku yaal saddex goobood oo unug hoosaadyo ah iyo sidoo kale qaabab calaamadineed oo kala duwan (Jaantus. 3b).Falanqaynta sawirka fluorescence waxay muujisay sifaynta sare ee PDPL (Jaantus. 3c).Socodka shaqada ee PDPL waxaa raacay falcelinta gujis oo leh dheeha rhodamine si loo kala saaro proteomes-ka-hoosaadka iyadoo la adeegsanayo microscopy fluorescence, iyo calaamadaha PDPL waxaa lagu midabeeyay DAPI, mitochondrial trackers, ama ER trackers, taasoo xaqiijinaysa daacadnimada sare ee PDPL.Saddexda goobood ee xubinta taranka, isbarbardhigga dhinac-dhinac ee PDPL iyo TurboID iyadoo la adeegsanayo avidin western blot waxay muujisay in PDPL si gaar ah loogu calaamadeeyay marka la barbar dhigo kantaroolkooda.Marka la eego xaaladaha PDPL, waxaa soo baxay kooxo calaamadeysan oo badan, kuwaas oo tilmaamaya borotiinno badan oo PDPL-calaamadeysan (Jaantuska Dheeraadka ah 6a-d).
matalaad qaabaysan ee miniSOG-dhexdhexaadin ah oo ka mid ah calaamadaynta borotiimka gaarka ah ee xubinta.miniSOG waxay bartilmaameed ka dhigtaa matrixka mitochondrial iyada oo loo marayo fiyuuska ilaa N-terminal 23 amino acids ee bini'aadamka COX4 (mito-miniSOG), xudunta iyada oo loo marayo fiyuuska H2B (nucleus-miniSOG), iyo Sec61b iyada oo loo marayo dhinaca cytoplasmic ee xuubka ER (ER-miniSOG). ).Tilmaamaha waxaa ka mid ah sawir-qaadista jel, sawir-qaadista, iyo spectrometry mass.b Sawirrada jelka ee saddex nooc oo gaar ah oo ka tirsan PDPL.CBB Coomassie Birilliant Blue.c Sawirada konfocal ee unugyada HEK293T oo si adag u muujinaya miniSOG oo leh meelayn unug-hoosaadyo kala duwan oo ay ogaadeen antibody-ku sumadeeyey V5 (casaan).Calaamadaha unugyada hoose waxaa loo isticmaalaa mitochondria iyo ER (cagaaran).Socodka shaqada ee PDPL waxaa ka mid ah ogaanshaha miniSOG (jaalle) boroteomyada unugyada unugyada hoose ee calaamadeysan iyadoo la adeegsanayo kimistariga Cy3-azide.Cabirka: 10 µmd Qorshayaasha foolkaanaha ee borootiomyada PDPL-ku-taagnaa ee xubnaha kala duwan ee lagu qiyaaso tiro aan calaamadayn (n = 3 tijaabo nafley madax-banaan).Imtixaanka t-Ardayga laba-dabo leh ayaa loo adeegsaday dhulalka foolkaanaha.Nooca duurjoogta ah ee HEK293T ayaa loo adeegsaday xakameyn xun. Borotiinno si weyn loo beddelay ayaa lagu muujiyey casaan (p <0.05 iyo> 2-laab kala duwanaanta xoojinta ion). Borotiinno si weyn loo beddelay ayaa lagu muujiyey casaan (p <0.05 iyo> 2-laab kala duwanaanta xoojinta ion). Значительно измененные белки выделены красным цветом Borotiinnada si weyn loo beddelay ayaa lagu muujiyey casaan (p <0.05 iyo> 2-laab kala duwanaanshaha xoogga ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Barootiinada si weyn loo beddelay ayaa lagu muujiyey casaan (p <0.05 iyo> 2-laab kala duwanaanshaha xoogga ionic).Barootiinada laxidhiidha ee muhiimka u ah HEK293T-miniSOG laakiin aan muhiim u ahayn HEK293T ayaa lagu muujiyay cagaar.e Falanqaynta gaarka ah ee xogta borotiinka ee tijaabooyinka d.Tirada guud ee borotiinada muhiimka ah ee ku jira xubin kasta (dhibcaha cas iyo cagaarka) ayaa lagu calaamadeeyay xagga sare.Histograms ayaa muujinaya borotiinno lagu meeleeyay organelles oo ku saleysan MitoCarta 3.0, GO analysis iyo A. Ting et al.dadka.Xog ururin gaar ah oo loogu talagalay mitochondria, nuclei, iyo ER.Tijaabooyinkan ayaa si madax-banaan lagu soo celceliyay ugu yaraan laba jeer natiijooyin isku mid ah.Xogta ceeriin waxaa lagu bixiyaa qaab faylal xog ceeriin ah.
Iyadoo lagu dhiirigelinayo jel iyo natiijooyinka sawir-qaadista, tirooyinka aan lahayn calaamadda ayaa la isticmaalay si loo qiyaaso borotiinka la aqoonsaday ee xubin kasta (Xogta Dheeraadka 2).HEK293T aan la beddelin ayaa loo isticmaalay sidii xakamayn taban si loo gooyo calaamadaha asalka. Falanqaynta qaabka Volcano waxay soo bandhigtay borotiinno si aad ah loo hodmay (p <0.05 iyo> 2-laab xoogga ion) iyo sidoo kale borotiinnada hal-abuurka ah ee kaliya ee ku jira khadadka muujinta miniSOG (Jaantus. 3d dhibco casaan iyo cagaar ah). Falanqaynta qaabka Volcano waxay soo bandhigtay borotiinno si aad ah loo hodmay (p <0.05 iyo> 2-laab xoogga ion) iyo sidoo kale borotiinnada hal-abuurka ah ee kaliya ee ku jira khadadka muujinta miniSOG (Jaantus. 3d dhibco casaan iyo cagaar ah). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Falanqaynta dhulalka Volcano waxay muujisay borotiinno si weyn loo hodmay (p <0.05 iyo> 2-laab xoogga ion) iyo sidoo kale borotiinnada kelida ah ee kaliya ee ku jira khadadka muujinaya miniSOG (Jaantus. 3d, dhibco casaan iyo cagaar)..火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Falanqaynta qaabka Volcano ayaa shaaca ka qaaday borotiinno si weyn loo hodmay (p <0.05 iyo> 2x xoogga ionic) iyo sidoo kale borotiinnada kelida ah oo keliya ayaa ku jira xariiqda muujinta miniSOG (dhibcaha cas iyo cagaarka ee sawirka 3d).Isku darka xogtan, waxaan aqoonsannay 1364, 461, iyo 911 tirakoob ahaan muhiimka ah ee nukliyeerka, mitochondrial, iyo borotiinnada xuubka sare ee ER, siday u kala horreeyaan.Si loo falanqeeyo saxnaanta organelle-localized PDPL, waxaan isticmaalnay MitoCarta 3.0, falanqaynta Gene Ontology (GO), iyo A. Ting et al.xogta set8 ayaa loo isticmaalay mitochondria, nucleus, iyo ER si loo tijaabiyo qeexida organelle ee borotiinnada la ogaaday, taas oo u dhiganta saxnaanta 73.4, 78.5, iyo 73.0% (Jaantus 3e).Gaarka ah ee PDPL waxay xaqiijinaysaa in PDPL ay tahay aalad ku habboon oo lagu aqoonsado borotiimooyinka gaarka ah ee xubinta.Waxaa xusid mudan, falanqaynta gudbinta ee borotiinka mitochondrial ee la aqoonsaday ayaa muujisay in borotiinka xanniban inta badan lagu qaybiyay matrixka iyo xuubka gudaha (226 iyo 106, siday u kala horreeyaan), oo u dhiganta 91.7% (362) tirada guud ee borotiinnada mitochondrial ee la aqoonsaday.heerka sare ee PDPL ayaa sidoo kale la xaqiijiyay (Jaantuska Dheeraadka ah. 7a).Sidoo kale, falanqaynta nukliyeerka hoose ayaa muujisay in borotiinka la qabtay inta badan lagu qaybiyay nukleus, nucleoplasm, iyo nucleolus (Jaantuska Dheeraadka ah. 7b).Falanqaynta borotiinka nukliyeerka ee leh calaamadda nukliyeerka nukliyeerka peptide (3xNLS) waxay muujisay saxnaanta la midka ah dhismaha H2B (Jaantuska Dheeraadka ah. 7c-h).Si loo go'aamiyo gaar ahaan calaamada PDPL, laminin nukliyeerka A waxaa loo doortay sidii dabin POI7 oo si gaar ah loo meeleeyay.PDPL waxay aqoonsatay 36 borotiinno si weyn loo hodmay, kuwaas oo 12 borotiino ah (30.0% ay ku jiraan lamin A) ay si fiican u sifoobeen lamin A oo la falgala borotiinada oo ay qeexday xogta String, oo leh boqolkiiba ka sarreeya habka BioID (122 borotiinada) 28 ee 28., 22.9 %) 7. Habkayagu waxa uu aqoonsaday borotiinno yar, lagana yaabo in ay ugu wacan tahay aagagga calaamadaynta xaddidan, taas oo ay suurtogalisay ogsijiin keli ah oo firfircoon.Falanqaynta GO waxay muujisay in borotiinnada la aqoonsaday ay inta badan ku yaalliin nucleoplasm (26), xuub nukliyeer (10), xuub nukliyeer (9), iyo daloolada nukliyeerka (5).Isku soo wada duuboo, borotiinadan nukliyeerka ah ayaa ku xisaabtamay 80% borotiinada la hodmay, taasoo sii tuseysa gaar ahaanta PDPL (Jaantuska Dheeraadka ah 8a-d).
Ka dib markii la aasaasay awoodda PDPL si ay u sameyso calaamadaynta u dhowaanshaha xubnaha, ka dib waxaan tijaabinay in PDPL loo isticmaali karo in lagu falanqeeyo wada-hawlgalayaasha isku xira POI.Gaar ahaan, waxaan raadinay inaan qeexno falanqaynta PDPL ee borotiinnada cytosolic, kuwaas oo loo tixgeliyo bartilmaameedyo aad u adag marka loo eego dhiggooda xuubka ku yaal sababtoo ah dabeecadooda aadka u firfircoon.Bromodomain iyo extraterminal (BET) borotiinka BRD4 ayaa soo jiidatay dareenkeena doorka muhiimka ah ee cudurada kala duwan 35, 36.Kakanaanta ay samaysay BRD4 waa isku-dubarid qoraal ah iyo bartilmaameed daweyn oo muhiim ah.Iyada oo la xakameynayo muujinta c-myc iyo Wnt5a qodobbada qoraalka, BRD4 waxaa loo maleynayaa inay tahay go'aamiye fure u ah cudurka 'myeloid leukemia' (AML), myeloma badan, lymphoma Burkitt, kansarka mindhicirka iyo cudurrada bararka37,38.Intaa waxaa dheer, fayrasyada qaar ayaa bartilmaameedsada BRD4 si ay u xakameeyaan fayraska iyo qoraalka gacanta, sida papillomavirus, HIV, iyo SARS-CoV-236,39.
Si loo sawiro isdhexgalka BRD4 anagoo adeegsanayna PDPL, waxaan ku darsanay miniSOG iyo N-ama C-terminal isoform gaaban oo BRD4 ah.Natiijooyinka borotiinku waxay daaha ka qaadeen isku-xidhnaan heersare ah oo u dhexeeya labada dhisme (Jaantuska Dheeraadka ah. 9a).Proteomeka nukliyeerka ee lagu aqoonsaday miniSOG-H2B wuxuu daboolayaa 77.6% borotiinada la falgalaya BRD4 (Jaantuska Dheeraadka ah. 9b).Kadib, waqtiyo kala duwan oo iftiin ah (2, 5, 10, 20 min) ayaa loo isticmaalay in lagu hagaajiyo raadiyaha calaamadeeyaha (Jaantus. 4a iyo xogta dheeriga ah 3).Waxaan ku soo gabagabeyneynaa in xilliyada sawir-qaadista ee gaaban, PDPL ay ugu horreyn calaamadeyn doonto la-hawlgalayaasha tooska ah, halka muddada dheer ay ku jiri doonaan borotiinno la aqoonsaday xilliyada gaaban ee sawir-qaadista iyo sidoo kale bartilmaameedyada aan tooska ahayn ee xarumaha calaamadaynta.Dhab ahaantii, waxaan helnay isugeyn xooggan oo u dhexeeya dhibcaha waqtiga ku xiga (84.6% 2 iyo 5 min; 87.7% 5 iyo 10 min; 98.7% 10 iyo 20 min) (Jaantus. 4b iyo Sawirka Dheeraadka 9c).Dhammaan kooxaha tijaabada ah, waxaan ka helnay ma aha oo kaliya BRD4 is-calaamadeynta, laakiin dhowr bartilmaameed oo caan ah sida MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, iyo HMGB1 oo lagu sharraxay xogta xargaha.Awoodda ionic ee bartilmaameedyadani waxay la mid tahay wakhtiga soo-gaadhista (Jaantus. 4c iyo Jaantuska Dheeraadka ah. 9d).Falanqaynta GO ee borotiinnada lagu aqoonsaday kooxda 2-daqiiqo waxay muujisay in borotiinnada la aqoonsaday ay ku yaalliin xudunta waxayna ku lug lahaayeen dib-u-habaynta chromatin iyo shaqada RNA polymerase.Shaqada molecular ee borotiinka ayaa lagu hodmay isku-xidhka chromatin ama isku-xidhka qoraalka, oo waafaqsan shaqada BRD4 (Jaantus. 4d).Falanqaynta isdhexgalka borotiinka ee String database-ka ayaa shaaca ka qaaday heerka koowaad ee isdhexgalka aan tooska ahayn ee u dhexeeya BRD4 iyo HDAC qoyska isdhexgalka ka kooban sida SIN3A, NCOR2, BCOR, iyo SAP130 (Jaantus. 4e iyo Sawirka Dheeraadka ah. ..Intaa waxaa dheer, bartilmaameedyada wakiillada ee ay aqoonsadeen LC-MS/MS, oo ay ku jiraan Sin3A, NSUN2, Fus, iyo SFPQ, ayaa lagu xaqiijiyay tirtiridda Galbeedka (Jaantus. 4f).Dhowaan, isoform-ga gaaban ee BRD4 ayaa la soo sheegay inay samaysato nuklei leh guryaha kala soocida dareeraha- dareeraha ah (LLPS).Barootiinada xidhitaanka RNA ee Fus iyo SFPQ waxay dhexdhexaadiyaan LLPS ee hababka gacanta ee kala duwan waxaana halkan lagu aqoonsaday inay yihiin borotiinno xidhidhiyaha BRD4 oo aan la diiwaangelin.Is dhexgalka u dhexeeya BRD4 iyo SFPQ waxaa lagu xaqiijiyay tijaabinta is-difaaca-ilaalinta (co-IP) (Jaantuska 4g), oo soo jeedinaya hannaan kale oo loogu talagalay kala-soocidda dareeraha dareeraha ah ee dhexdhexaadinta BRD4 oo u qalma baaritaan dheeraad ah.Isku soo wada duuboo, natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in PDPL ay tahay madal ku habboon oo lagu aqoonsan karo BRD4 wada-shaqaynta la yaqaan iyo sidoo kale borotiinada xidha ee aan la garanayn.
Matalaadda qaabaysan ee miniSOG-dhexdhexaadinaysa BRD4 calaamadaynta u dhawaanshaha, waqtiyada soo-gaadhista: 2, 5, 10, iyo 20 min.b Isku dhafka borotiinada lagu aqoonsaday waqtiyo kala duwan oo iftiin ah.Kobcinta borotiinka ee lagu aqoonsaday HEK293T-miniSOG-BRD4 waxay ahayd mid aad muhiim u ah marka la barbar dhigo nooca duurjoogta ah ee HEK293T.c Ion xoojinta marka la xisaabinayo wakiilka aan la calaamadsan ee loo yaqaan borotiinnada xidha BRD4 inta lagu jiro wakhtiga la cayimay.n = 3 muunado nafley ah oo madaxbannaan.Xogta waxaa loo soo bandhigay celcelis ahaan ± weecasho caadi ah.d Falanqaynta hidda-wadaha Ontological (GO) ee borotiinnada lagu aqoonsaday kooxda 2-daqiiqo ah.Tobanka shuruudood ee ugu horreeya GO ayaa ku qoran.Xumbooyinku waxay midabaysan yihiin iyadoo loo eegayo qaybta ereyga GO, cabbirka xumbo-kuna wuxuu la mid yahay tirada borotiinnada laga helo erey kasta.e String falanqaynta borotiinada la falgalaya BRD4.Wareegyada jaalaha ah waa xabag toos ah iyo wareegyada cawl waa lakabka koowaad ee xabagta aan tooska ahayn.Xariiqyada guduudan waxay u taagan yihiin isdhexgalka si tijaabo ah loo go'aamiyay iyo khadadka buluuga ah waxay matalaan isdhexgalka la saadaaliyay.• Wakiilada BRD4 bartilmaameedyada xidhidha ee lagu aqoonsaday LC-MS/MS waxa xaqiijiyay bakhtiyaynta reer galbeedka.g Tijaabooyinka is-difaaca-is-dhaafsiga waxay xaqiijinayaan is-dhexgalka ka dhexeeya SFPQ iyo BRD4.Tijaabooyinkan ayaa si madax-banaan lagu soo celceliyay ugu yaraan laba jeer natiijooyin isku mid ah.Xogta ceeriin waxaa lagu bixiyaa qaab faylal xog ceeriin ah.
Marka lagu daro aqoonsiga bartilmaameedyada POI-da ee aan diiwaangashanayn, waxaan qiyaasaynaa in PDPL ay ku haboonaan doonto aqoonsiga substrates ee ensaymes, taas oo u baahan doonta sifeynta borotiinnada isku xiran ee aan tooska ahayn ee dhismooyinka waaweyn si loo qeexo substrates aan diiwaangashanayn.Parkin (oo lagu dhejiyay PARK2) waa E3 ligase iyo isbeddellada ku dhaca baarkinka ayaa la og yahay inay sababaan cudurka Parkinson ee dhallinta yar (AR-JP)42.Intaa waxaa dheer, parkin ayaa lagu tilmaamay inay lagama maarmaan u tahay mitophagy (mitochondrial autophagy) iyo ka saarida noocyada ogsijiinta falcelinta.Si kastaba ha ahaatee, inkasta oo dhowr substrate-ka baarkin la aqoonsaday, doorka parkin ee cudurkan ayaan weli caddayn.Si loo qeexo substrate-keeda aan la sifeyn, PDPL waxaa la tijaabiyay iyadoo lagu daray miniSOG N- ama C-terminus of parkin.Unugyada waxaa lagu daaweeyay gaadiidleyda karbonyl cyanide proton m-chlorophenylhydrazone (CCCP) si loo dhaqaajiyo baarkinka iyadoo la marayo dariiqa PINK1-Parkin.Marka la barbar dhigo natiijooyinkayaga BRD4 PDPL, isku-darka N-terminus parkin ayaa muujiyay tiro balaadhan oo borotiinno bartilmaameed ah, in kasta oo ay dabooshay qayb weyn oo ka mid ah C-terminus (177 ee 210) (Jaantuska 5a,b iyo Xogta Dheeraadka ah 4).Natiijadu waxay la socotaa warbixinnada sheegaya in N-terminal tags ay si aan macquul ahayn u kicin karaan Parkin44.Waxa la yaab leh, waxa xogtayada ku jiray 18 borotiinno is-dul-saaran oo leh natiijooyin AP-MS ah oo la daabacay ee Parkin43, oo ay u badan tahay inay sabab u tahay kala duwanaanshaha u dhexeeya xadadka gacanta iyo socodka shaqada borotiinka.Marka lagu daro afar borotiinada la yaqaan (ARDM1, HSPA8, PSMD14, iyo PSMC3) oo lagu aqoonsaday laba hab (Jaantus. 5c)43.Si loo sii ansixiyo natiijooyinka LC-MS/MS, daawaynta PDPL iyo xoqidda reer galbeedka ee xigtay ayaa loo adeegsaday isbarbardhigga natiijooyinka baaritaanka unugyada waalidka ee HEK293T iyo khadka N-terminal parkin ee deggan.Bartilmaameedyada aan hore loo aqoon CDK2, DUT, CTBP1, iyo PSMC4 ayaa lagu tijaabiyay xidhe la yaqaan, DNAJB1 (Jaantus. 5d).
Dhulka Volcano ee borotiinada is dhexgalka baarkinka ee unugyada HEK293T oo si adag loo muujiyey miniSOG oo ku dheggan N- ama C-terminus ee baarkin (n = 3 tijaabo nafley madax-bannaan).Imtixaanka t-Ardayga laba-dabo leh ayaa loo adeegsaday dhulalka foolkaanaha.HEK293T waxaa loo adeegsaday xakameyn taban. Borotiinno si weyn loo beddelay ayaa lagu muujiyey casaan (p <0.05 iyo> 2-laab kala duwanaanta xoojinta ion). Borotiinno si weyn loo beddelay ayaa lagu muujiyey casaan (p <0.05 iyo> 2-laab kala duwanaanta xoojinta ion). Значительно измененные белки выделены красным цветом Borotiinnada si weyn loo beddelay ayaa lagu muujiyey casaan (p <0.05 iyo> 2-laab kala duwanaanshaha xoogga ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Barootiinada si weyn loo beddelay ayaa lagu muujiyey casaan (p <0.05 iyo> 2-laab kala duwanaanshaha xoogga ionic).Barootiinada laxidhiidha ee muhiimka u ah HEK293T-miniSOG laakiin aan muhiim u ahayn HEK293T ayaa lagu muujiyay cagaar.b jaantuska Venn oo muujinaya borotiinno is dulsaaran oo u dhexeeya N-terminal iyo C-terminal dhiska.Calaamadaha N-terminal waxay si aan leexleexad lahayn u kicin karaan baarkin waxayna keenaan borotiinno badan oo la aqoonsan karo.c jaantuska Venn oo muujinaya borotiinno is dulsaaran oo u dhexeeya PDPL iyo AP-MS.Is-dhexgalka la yaqaan ayaa liiska ku jira, oo ay ku jiraan 4 ka mid ah 18 borotiinno is-dul-saaran iyo 11 ka mid ah 159 borotiinada si gaar ah loogu aqoonsaday PDPL.d Bartilmaameedyada wakiillada ee ay aqoonsadeen LC-MS/MS waxaa xaqiijiyay bakhtiyaynta reer galbeedka.e Ssu72 iyo SNW1 ayaa loo aqoonsaday inay yihiin substrate-ka baarkin ee aan diiwaangashanayn.Plasmaidyada borotiinka ee calaamadeysan calanka waxaa loo kala bedelay HEK293T iyo HEK293T-Parkin-miniSOG oo ay ku xigto daawaynta CCCP waqtiyo kala duwan.Hoosudhaca ayaa si aad ah ugu caddeeyey khadka xad dhaafka ah ee Parkin.Isticmaalka proteasome inhibitor MG132, waxaa la xaqiijiyay in habka hoos u dhaca ee Ssu72 iyo SNW1 ay dhexdhexaadiyaan proteasome-meel kasta.Tijaabooyinkan ayaa si madax-banaan lagu soo celceliyay ugu yaraan laba jeer natiijooyin isku mid ah.Xogta ceeriin waxaa lagu bixiyaa qaab faylal xog ceeriin ah.
Waxaa xusid mudan, borotiinada ay aqoonsatay PDPL waa inay ku jiraan borotiinada xidha baarkin iyo substrate-kooda.Si loo ogaado substrate-ka baarkinka ee aan diiwaangashanayn, waxaanu dooranay todoba borotiino oo la aqoonsaday (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 iyo SNW1) iyo plasmids la kala bedelay si ay u soo bandhigaan hiddo-wadahan HEK293T caadiga ah oo ay si adag u muujiyaan miniSOG-Parkin's HEK2CCCPTHeerarka borotiinka Ssu72 iyo SNW1 ayaa si weyn hoos ugu dhacay khadka miniSOG-Parkin ee deggan (Jaantus. 5e).Daawaynta CCCP ee 12 saacadood waxay keentay hoos u dhaca ugu weyn ee labada substrates.Si loo baaro in hoos u dhigista Ssu72 iyo SNW1 lagu xakameynayo proteasome-ubiquitination, proteasome inhibitor MG132 ayaa lagu daray si loo joojiyo dhaqdhaqaaqa proteasome, iyo dhab ahaantii waxaan ogaanay in nidaamkooda hoos u dhigista la xannibay (Jaantus 5f).Bartilmaameedyada dheeraadka ah ee aan substrate-ka ahayn ayaa la xaqiijiyay inay yihiin is-dhex-gallayaasha Parkin oo isticmaalaya dhufashada Galbeedka (Jaantuska Dheeraadka ah. 10), kaas oo muujiyay natiijooyin joogto ah LC-MS/MS.Gebogebadii, isku dhafka shaqada ee PDPL oo leh xaqiijinta gudbinta borotiinka ee bartilmaameedka ayaa u oggolaanaysa aqoonsiga E3 ligase substrates ee aan diiwaangashanayn.
Waxaan sameynay meel u dhow dhow oo calaamadeyneysa taas oo kuu ogolaaneysa inaad ku aqoonsato meel bannaan iyo waqtiga POIs isdhexgalka.Madalku wuxuu ku salaysan yahay borotiinka sawir-qaadista ee miniSOG, kaas oo kaliya qiyaastii 12 kDa, in ka yar kala badh cabbirka APEX2 enzyme ee baaluq ah (27 kDa) iyo saddex meelood meel cabbirka TurboID (35 kDa).Cabbirka yar waa inuu si weyn u balaadhiyaa kala duwanaanshaha codsiyada lagu baranayo isdhexgalka borotiinka yar yar.Sahamin dheeraad ah oo sawir-qaadeyaal dheeri ah, hadday yihiin borotiinno hidde-side ah ama unugyo yar-yar, ayaa loo baahan yahay si loo kordhiyo soosaarka tirada ee ogsijiinta kelida ah loona kordhiyo dareenka habkan.Nooca hadda ee miniSOG, xallinta ku meel gaarka sare waxaa lagu gaari karaa iyadoo la adeegsanayo iftiin buluug ah si loo dhaqaajiyo calaamadaha u dhow.Intaa waxaa dheer, wakhti dheer oo soo-gaadhis ah ayaa sii daayay "daruur" weyn oo ogsijiin ah, taasoo keentay in wax laga beddelo haraaga histidine-ka fog, kor u kaca calaamadaynta, iyo awoodda lagu hagaajinayo xallinta dhulka ee PDPL.Waxa kale oo aanu tijaabinay todoba baadhitaan oo kiimiko ah si aanu u kordhino saamiga ishaarooyinka-ilaa-saldhigga oo aanu baadhnay habka molecular ee ka dambeeya habkan.Socodka shaqada TOP-ABPP oo ay weheliso raadin furan oo aan eex lahayn ayaa xaqiijisay in wax-ka-beddelku ka dhacay kaliya histidines oo aan la arkin microenvironment joogto ah oo loogu talagalay isbeddellada histidine ee kordhay, marka laga reebo doorbid dhexdhexaad ah ee histidines ee gobolka loop.
PDPL waxa kale oo loo isticmaalay in lagu sifeeyo proteomes-ka-hoosaadka oo leh gaar ahaan proteome iyo caynsanaanta ugu yaraan la barbardhigi karo calaamadaynta kale ee u dhow iyo hababka baaritaanka kiimikaad gaar ah oo xubinta ka ah.Calaamadaha u dhawaanshaha ayaa sidoo kale si guul leh loo isticmaalay si loo garto oogada, lysosomal, iyo proteomes-la-xidhiidha sirta ah46,47.Waxaan aaminsanahay in PDPL ay la jaanqaadi doonto unugyada unugyada hoose.Intaa waxaa dheer, waxaan ku loolannay PDPL anaga oo aqoonsanay bartilmaameedyada isku xira borotiinka cytosolic ee ka adag borotiinnada ku xiran xuubka sababtoo ah sifooyinkooda firfircoon iyo ku lug lahaanshaha isdhexgalka ku meel gaarka ah.PDPL waxa lagu dabaqay laba borotiino, isku xidhaha qoraalka BRD4 iyo ligase E3 Parkin la xidhiidha.Labadan borotiinada looma dooran oo keliya hawlahooda aasaasiga ah ee bayooloji, laakiin sidoo kale waxay ku habboon yihiin bukaan-socodkooda iyo awooddooda daawaynta.Labadan POI, wada-hawlgalayaasha xidhidhka ee caanka ah iyo sidoo kale bartilmaameedyada aan diiwaangashanayn ayaa la aqoonsaday.Waxaa xusid mudan, borotiinka SFPQ ee laxidhiidha kala-soocidda wejiga waxaa xaqiijiyay la-IP, taas oo muujin karta hannaan cusub oo BRD4 (gaaban) ay ku maamusho LLPS.Isla mar ahaantaana, waxaan aaminsanahay in aqoonsiga substrates Parkin ay tahay xaalad taas oo aqoonsiga xabagta aan tooska ahayn loo baahan yahay.Waxaanu aqoonsanay laba qaybood oo baarkin ah oo aan la aqoonsan waxaana aanu xaqiijinay hoos u dhacooda dhanka dariiqa beerista-proteasome.Dhawaan, istaraatijiyad ku-saleysan dabineed ayaa la sameeyay si loo ogaado substrate-ka hydrolase iyadoo lagu xirayo enzymes.Inkasta oo tani ay tahay hab aad u awood badan, kuma haboona falanqaynta substrates ee ku lug leh samaynta dhismooyin waaweyn waxayna u baahan tahay samaynta bonds covalent ee u dhexeeya enzyme iyo substrate-ka.Waxaan filaynaa in PDPL la kordhin karo si loo barto isku dhisyada borotiinka iyo qoysaska enzyme-ka, sida qoysaska deubiquitinase iyo metalloprotease.
Nooc cusub oo miniSOG ah, oo loo yaqaan SOPP3, ayaa lagu sameeyay soo saarista ogsijiinta hal keli ah.Waxaan is barbar dhignay miniSOG iyo SOPP3 waxaana helnay wax qabad calaamadeyn ah oo soo hagaagtay, in kasta oo saamiga calaamad-ilaa-sanqa uu ahaa mid aan isbeddelin (Jaantuska Dheeraadka ah. 11).Waxaan ku qiyaasnay ​​in hagaajinta SOPP3 (tusaale, horumar la hagayo) ay horseedi doonto borotiinno sawir-qaade oo waxtar leh oo u baahan waqtiyo iftiin gaaban oo sidaas darteed u oggolaanaya in la qabsado habab gacanta oo firfircoon oo firfircoon.Waxaa xusid mudan, nooca hadda ee PDPL wuxuu ku kooban yahay deegaanka gacanta maadaama ay u baahan tahay iftiin buluug ah mana geli karo unugyo qoto dheer.Habkani waxa uu diidayaa in loo isticmaalo daraasaadka qaabka xayawaanka.Si kastaba ha noqotee, isku dhafka optogenetics iyo PDPL waxay siin kartaa fursad cilmi-baarista xayawaanka, gaar ahaan maskaxda.Intaa waxaa dheer, sawir-qaadayaasha kale ee la farsameeyay ee infrared-ka ayaa sidoo kale meesha ka saaraya xaddidan.Cilmi baaris ayaa hadda ka socota goobtan.
Khadka unugyada HEK293T waxaa laga helay ATCC (CRL-3216).Khadka unuggu wuxuu tijaabiyey diidmada caabuqa mycoplasma waxaana lagu beeray DMEM (Thermo, #C11995500BT) oo lagu kabay 10% serum bovine (FBS, Vistech, #SE100-B) iyo 1% penicillin/streptomycin (Hyclone, #SV30010).ku koray.
3-Aminophenylene (muunada 3) iyo (4-ethynylphenyl) methanamin (muunada 4) ayaa laga soo iibsaday Bidepharm.Propylamine (probe 2) waxaa laga soo gatay kiimikooyinka tamarta.N- (2-Aminophenyl) pent-4-ynamide (probe 1) ayaa la soo saaray iyadoo loo eegayo hababka la daabacay.
Jadwalka dheeriga ah ee 1 wuxuu taxayaa dhismooyinka hidda-socodka ee loo adeegsaday daraasaddan.Taxanaha miniSOG iyo KillerRed ayaa laga soo minguuriyay plasmid hadiyad ka timid P. Zou (Jaamacadda Peking).Matrixka mitochondrial ee isku xigxiga ee bartilmaameedka ah waxa laga soo minguuriyay 23 N-terminal amino acids ee COX4 oo lagu xidhay faleebo la tilmaamay iyadoo la isticmaalayo golaha Gibson (Beyotime, #D7010S).Si loo beegsado xuubka iyo nukleus ee reticulum endoplasmic, SEC61B DNA bini'aadamka (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) waxaa xoojiyay PCR maktabadda cDNA ee unugyada HEK293T, iyo H2B DNA (oo ay ku deeqday D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) iyo cloned , sida kor ku xusan.Haddii aan si kale loo sheegin, hiddo-wadaha borotiinka ee loo isticmaalo isu-gudbinta iyo dhismaha khadadka unugyada xasilloon ayaa PCR laga soo kordhiyey maktabadda unugga HEK293T ee cDNA.G3S (GGGS) iyo G4S (GGGGS) ayaa loo isticmaalay sidii isku xidhayaasha u dhexeeya borotiinka bait iyo miniSOG.V5 summada epitope (GKPIPNPLLGLDST) ayaa lagu daray dhismooyinkan isku-dhafka ah.Si loo muujiyo naasleyda iyo si loo dhiso khad unug xasilloon, isku dhafka miniSOG ayaa la hoos geliyay fayraska lentiviral pLX304.Bakteeriyada muujinta, miniSOG waxaa lagu xidhay pET21a vector ku calaamadsan 6xHis ee C-terminus.
Unugyada HEK293T waxaa lagu beeray 2.0 x 105 unug kasta oo ku yaal saxan lix-ceel ah waxaana lagu beddelay 24 saacadood ka dib plasmids lentiviral recombinant (2.4 μg pLX304) iyo plasmids baakadaha fayraska (1.5 μg psPAX2 iyo 1.2.2.8G , #C0533), qiyaastii 80% isku-dhafka.Ka dib markii habeenkii la gooyay, dhexdhexaadiyaha waa la bedelay oo lagu daray 24 saacadood oo kale.Ururinta fayraska waxaa la sameeyay 24, 48 iyo 72 ka dib.Kahor infekshanka xariiqyada unugyada bartilmaameedka, dhexdhexaadiyaha fayraska waxaa lagu sifeeyay 0.8 μm filter (Merck, #millex-GP) iyo polybrene (Solarbio, #H8761) ayaa lagu daray fiirsashada 8 μg/ml.24 saacadood ka dib, unugyada ayaa loo oggolaaday inay soo kabtaan iyadoo la beddelayo dhexdhexaadiyaha.Unugyada waxaa lagu doortay iyadoo la adeegsanayo 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) saddexda marin ee ugu horreeya sida xulashada adag ee hoose.Kadibna loo isticmaalo 20 μg/ml sidii nidaam aad u adag ee saddexda tuduc ee soo socda.
Unugyada waxaa lagu beeray 12-qol oo ceel ah (Ibidi, #81201) cufnaanta qiyaastii 20,000 unug ceelkiiba.Si loo hagaajiyo xabagta unugyada HEK293T, ku dar 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) oo lagu qasi jiray cusbada fosfatetada buffered (PBS, Sangon, #B640435) at 37°C.Qolalka waxaa lagu sii daayay 1 saac ka dibna laga saaray PBS.24 saacadood ka dib, unugyadu hal mar ayaa lagu maydhay PBS, oo lagu daray 1 mM probe 3 oo ah xal cusbo dheeli tiran oo Hanks ah (HBSS, Gibco, #14025092) 1 saac at 37°C, ka dibna waxaa lagu dhex galiyay LED buluug ah (460 nm). ).) ayaa lagu shubay 10 min heerkulka qolka.Intaa ka dib, unugyada waxaa lagu maydhay laba jeer PBS waxaana lagu hagaajiyay 4% formaldehyde ee PBS (Sangon, #E672002) 15 daqiiqo heerkulka qolka.Formaldehyde xad dhaaf ah ayaa laga saaray unugyo go'an iyadoo saddex jeer lagu dhaqay PBS.Unugyada ayaa markaa lagu dalacsiiyay 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) ee PBS waxaana lagu maydhay 3 jeer PBS.Kadibna ka saar qolka oo ku dar muunad kasta 25 µl oo ah falcelin riix ah oo ka kooban 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) iyo 0.5 mg/ml sodium ascorbate (Aladdin, no. S105024) oo lagu shubay 30 daqiiqo heerkulka qolka.Ka dib falcelin degdeg ah, unugyo ayaa la maydhay lix jeer iyada oo PBS ay ka kooban tahay 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ka dibna lagu xannibay 5% BSA (Abcone, #B24726) gudaha PBST 30 daqiiqo heerkulka qolka.
Immunostaining collocalization, unugyada waxaa lagu daray unugyada difaaca aasaasiga ah iyadoo loo eegayo shuruudaha la tilmaamay: mouse anti-V5 tag mAb (1: 500, CST, # 80076), bakayle anti-Hsp60 mAb (1: 1000), ABclonal, #A0564), Bakayle polyclonal anti-calnexin antibody (1:500, Abcam, #ab22595) ama bakaylaha anti-lamin A/C monoclonal antibody (1:500; CST, #2032) at 4 °C habeenkii.Ka dib markii lagu dhaqay 3 jeer PBST, unugyada waxaa lagu daray unugyada difaaca jirka ee labaad: riyaha ka hortagga bakaylaha Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) oo la qasi jiray 1:1000, riyaha anti-mouse Alexa Fluor 594 (CST, #8889) waa la qasi jiray 1:1000.qaso Ku qas heerkulka qolka 30 daqiiqo.Unugyada ayaa markaa lagu dhaqay 3 jeer PBST waxaana lagu daaweeyay DAPI (Thermo, #D1306) gudaha PBS 10 daqiiqo heerkulka qolka.Ka dib markii 3 lagu dhaqay PBS, unugyada waxaa lagu shaabadeeyey 50% glycerol (Sangon, #A600232) gudaha PBS si loo sawiro.Sawirada Immunofluorescent ayaa la helay iyadoo la isticmaalayo ZEISS LSM 900 Airyscan2 confocal microscope iyo software ZNE 3.5.
Sawirka fluorescent-ka oksijiinta hal-abuurka ah, unugyadu waxa lagu maydhay laba jeer oo lagu kaydiyay Hanks HEPES ka hor inta aan lagu darin 100 nM Si-DMA ee Hanks HEPES kaydiye (DOJINDO, #MT05).Ka dib soo-gaadhista iftiinka, unugyadu waxay ku dhexjireen CO2 incubator at 37 ° C 45 daqiiqo.Unugyada ayaa markaa laba jeer lagu maydhay Hanks 'HEPES bakhaar waxaana lagu dhajiyay Hoechst ee Hanks' HEPES kaydinta 10 daqiiqo heerkulka qolka waxaana lagu sawiray iyadoo la isticmaalayo mikroskoob ZEISS LSM 900 ah., #M36008) oo ku jira kaydka HBSS oo ka kooban calcium iyo magnesium.Ka dib soo-gaadhista iftiinka ama doxorubicin (MCE, #HY-15142A), unugyadu waxa lagu dabay CO2 incubator at 37° C. 10 daqiiqo, laba jeer ayaa lagu maydhay HBSS baffer, waxaana lagu dhex daaray Hoechst ee kaydka HBSS heerkulka qolka.daqiiqado.Doxorubicin waxa loo isticmaalay sidii xakamaynta baadhista togan halka unugyada lagu daaweeyay 20 μM doxorubicin ee HBSS oo ka kooban 1% BSA 30 daqiiqo.Sawirada Immunofluorescent ayaa la helay iyadoo la isticmaalayo Zeiss LSM 900 mikroskoob confocal.
Unugyada HEK293T ee si adag u muujinaya mito-miniSOG ayaa lagu beeray cufnaan ku dhow 30% saxannada 15cm.48 saacadood ka dib, markii ~ 80% isku darka la gaadhay, unugyadu hal mar ayaa lagu maydhay PBS, oo lagu dhex galiyay 1 mM Probe 3 oo ku jira kaydka HBSS cusub 1 saac oo ah 37°C ka dibna lagu iftiimiyay LED buluug ah 10 daqiiqo qolka. heerkulka..Intaa ka dib, unugyada laba jeer ayaa lagu maydhay PBS, la xoqay oo dib loogu celiyay baraf qaboobaha qaboobaha PBS oo ay ku jiraan EDTA-free protease inhibitors (MCE, #HY-K0011).Unugyada ayaa la jeexjeexay iyada oo caarada 1 daqiiqo la jeexjeexay (1 ilbiriqsi iyo 1 ilbiriqsi oo ka baxsan 35% baaxadda).Isku darka ka soo baxay waxaa lagu xardhay 15,871 xg 10 min at 4 ° C si meesha looga saaro qashinka, iyo fiirsashada sare waxaa lagu hagaajiyay 4 mg / mL iyadoo la adeegsanayo xirmada baaritaanka borotiinka BCA (Beyotime, #P0009).Isku dar 1 ml oo ah lysate-ka sare iyo 0.1 mM biotin azide photodegradable (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437), iyo 1 mM CuSO4 ee hoose wareeg ilaa 1 saac heerkulka qolka.Falcelinta degdega ah ka dib, ku dar isku dhafka xalkii hore ee la isku daray (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) ee dhalo dhalada ah 10 ml.Tijaabooyinku waa la isku qasay oo la saaray 4500 g 10 daqiiqo heerkulka qolka.Xalalka hoose iyo kuwa sare waa la tuuray, qulqulka waxaa lagu maydhay laba jeer 1 ml oo methanol ah waxaana lagu dhejiyay 15871 × g 5 min at 4 ° C.Ku dar 1 ml oo ah 8 M urea (Aladdin, no. U111902) ee 25 mM ammonium bicarbonate (ABC, Aladdin, no. A110539) si loo milo roobka.Tusaalooyinka waxaa lagu soo celiyay 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 gudaha 25 mM ABC) 40 daqiiqo at 55°C ka dibna lagu daray 15 mM iodoacetamide cusub (Sangon, #A600539) heerkulka qolka gudcurka.Alkylation 30 daqiiqo gudahood..5 mM dithiothreitol dheeraad ah ayaa lagu daray si loo joojiyo falcelinta.U diyaari ku dhawaad ​​100 µl NeutrAvidin agarose kuul (Thermo, #29202) muunad kasta adigoo ku dhaqaya 3 jeer 1 ml PBS.Xalka borotiinka ee kor ku xusan waxaa lagu qasi jiray 5 ml PBS waxaana lagu daray horay loo dhaqay oo NeutrAvidin agarose ah oo loogu talagalay 4 saacadood heerkulka qolka.Kuulku waxa la maydhay 3 jeer 5 ml PBS oo ka kooban 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 jeer oo leh 5 ml PBS oo ka kooban 1M HOL, iyo 3 jeer oo leh 5 ml ddH2O.Kuulaha ayaa markaa lagu goostay centrifugation waxaana dib loo hakiyay 200 μl oo 25 mM ABC ah oo ka kooban 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) iyo 20 ng/μl trypsin (Promega, #V5280).Isku day heerkulka 37 ° C habeenkii oo wareeg ah.Dareen-celinta waxaa la joojiyay iyadoo lagu daray formic acid (Thermo, # A117-50) ilaa pH ay gaartay 2-3.Kuulaha waxaa lagu maydhay 3 jeer 1 ml oo PBS ah oo ka kooban 0.2% SDS, 3 jeer 1 ml PBS oo ay ku jirto 1 M HOL, ka dibna 3 jeer 1 ml oo biyo nadiif ah.Peptides-ka wax laga beddelay waxaa lagu sii daayay lysis iftiin (365 nm) 90 min iyadoo la adeegsanayo 200 μl ee 70% MeOH.Ka dib centrifugation, supernatant ayaa la ururiyey.Kuulaha ayaa markaa lagu dhaqay hal mar iyadoo 100 μl oo ah 70% MeOH la isku daray.Muunooyinku waxa lagu qallajiyey kaydiyaha faakuumka ee Speedvac waxaana lagu kaydiyey -20°C ilaa la falanqaynayo.
Si loo aqoonsado oo loo qiyaaso peptides-ka oksijiinta la beddelay, muunado ayaa dib loogu milmay 0.1% formic acid iyo 1 μg ee peptides ayaa lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo spectrometer mass spectrometer Orbitrap Fusion Lumos Tribrid oo ku qalabaysan isha nano ESI ee Tune iyo Xcalibur oo ka yimid software iibiyaha 4.3.Muunado ayaa lagu kala soocay 75 µm × 15 cm gudaha kakooban tiir kabillar oo leh 3 µm C18 walxo (ReproSil-pur, #r13.b9.) oo lagu xiray EASY-nLC 1200 UHPLC nidaamka (Thermo).peptides-yada waxaa lagu kala soocay chromatography toosan oo 95 daqiiqo ah laga bilaabo 8% dareere B ilaa 50% dareeraha B (A = 0.1% formic acid ee biyaha, B = 0.1% formic acid gudaha 80% acetonitrile), ka dibna si toos ah u kordhay ilaa 98% B min 6 daqiqo gudaheed xadiga socodka 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos waxay uruurisaa xogta si beddel ah inta u dhaxaysa iskaanka MS buuxa iyo iskaanka MS2 iyadoo ku xidhan xogta.Korantada xajinta waxaa loo dejiyay 2.1kV heerkulka ion gaadiidka ion wuxuu ahaa 320°C.spectra MS (350-2000 m/z) waxaa lagu soo ururiyay xal 120,000, AGC 4 × 105, iyo ugu badnaan wakhtiga wax gaynta 150 ms.10-ka hormood ee ugu caansan ee isku dhufashada ee skaan kasta oo buuxa ayaa la kala qaybiyey iyadoo la isticmaalayo HCD oo leh tamar isku dhac caadi ah oo ah 30%, daaqad go'doon oo afar-rupole ah oo ah 1.6 m/z, iyo dejinta xallinta 30,000.Bartilmaameedka AGC ee spectrometry mass mass tandem iyadoo la adeegsanayo 5 × 104 iyo waqtiga ugu badnaan 150 ms.Marka laga reebo firfircooni waxa lagu dejiyay 30 ilbiriqsi. Iions aan la magacaabin ama kuwa leh 1+ iyo>7+ ayaa loo diiday MS/MS. Iions aan la magacaabin ama kuwa leh 1+ iyo>7+ ayaa loo diiday MS/MS. Неназначеные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Iions ama ion aan la magacaabin oo leh 1+ iyo>7+ ayaa loo diiday MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неукаzannые Iions ama ion aan la cayimin oo lagu eedeyay 1+ iyo>7+ ayaa loo diiday MS/MS.
Xogta ceyriinka ah waxaa lagu farsameeyaa iyadoo la isticmaalayo FragPipe computing platform ku salaysan MSFragger.Eexda tirada badan iyo asiidhyada amino-ka ee u dhigma ayaa lagu go'aamiyay iyadoo la isticmaalayo algorithm raadin furan oo leh dulqaad ballaaran oo horudhac ah -150 ilaa 500 Da.peptides wax laga beddelay ayaa markaa la aqoonsaday iyadoo la adeegsanayo isbeddellada histidine oo leh faa'iidooyin ballaaran +229.0964 iyo +247.1069 Da ee PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Unugyada si adag u muujinaya hiddo-wadaha miniSOG ee isku qasan ayaa lagu dahaadhay saxamada 6cm.Marka la gaaro ~80% isku darka, unugyadu hal mar ayaa lagu dhaqay HBSS (Gibco, #14025092), ka dibna waxaa lagu dhex geliyay baaritaan kiimiko gudaha HBSS 1 saac oo ah 37°C waxaana lagu iftiimiyay iftiin buluug ah.10W LED 20 daqiiqo heerkulka qolka.Si loo go'aamiyo nooca oksijiinta falcelinta ee ku lug leh PDPL, 0.5 mM vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 mM mannitol (Tamarta Kiimikada, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 ayaa lagu daray unugyada si kabitaan ah.Ka dib markii lagu dhaqay PBS qabow, unugyada waa la xoqay, waxaa lagu ururiyay 1.5 ml tuubooyinka centrifuge, iyo sonicated leh caarad 1 min gudaha 200 μl ee PBS oo leh 1x protease inhibitor oo aan lahayn EDTA (1 s iyo 1 s la'aan, baaxadda 35%).Isku darka ka soo baxay waxaa lagu xareeyay 15,871 × g 10 min at 4 ° C iyo xoogga sare waxaa lagu hagaajiyay 1 mg/mL iyadoo la adeegsanayo xirmada baaritaanka borotiinka BCA.Qiyaastii 50 µl ee lysate-ka sare waxaa lagu dhajiyay 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, iyo 1 mM CuSO4 1 saac heerkulka qolka oo wareeg ah hoos ilaa sare.Ka dib falcelinta gujinta, roobka leh acetone waxaa lagu sameeyay iyadoo lagu darayo 250 μl oo acetone hore loo qaboojiyey shaybaarada, lagu beeray -20 ° C 20 min iyo centrifuging at 6010 × g 10 min at 4 ° C.Soo ururi pellet oo ku kari 50 µl oo ah 1x Laemmli kaydka 10 daqiiqo at 95 °C.Muunado ayaa markaa lagu falanqeeyay SDS-PAGE gelyada dhaadheer waxaana la sawiray iyadoo la isticmaalayo Bio-rad ChemiDoc MP Touch imaging system oo leh software Image Lab Touch.
Muujinta iyo nadiifinta miniSOG-6x borotiinka dib-u-dhiska ayaa loo sameeyay sidii hore loo sharraxay.Si kooban, unugyada E. coli BL21 (DE3) (TransGen, #CD701-02) ayaa lagu beddelay pET21a-miniSOG-6xHis iyo muujinta borotiinka waxaa lagu soo bandhigay 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Ka dib lysis unug, borotiinada ayaa lagu sifeeyay iyadoo la isticmaalayo Ni-NTA agarose kuul (MCE, no. 70666), oo laga sifeeyay PBS, laguna kaydiyay -80°C.
Qiyaasta u dhowaanshaha summada-ka-hortagga ee vitro, ku dar 100 μM miniSOG la safeeyey, 1 mM probe 3, iyo 1 μg ka-hortagga sumadda mouse monoclonal antibody (TransGen, #HT501-01) gudaha PBS ilaa wadarta mugga falcelinta ee 50 μl..Isku darka falcelinta waxaa lagu shiday iftiin buluug ah oo LED ah oo loogu talagalay 0, 2, 5, 10, iyo 20 min heerkulka qolka.Isku darka waxaa lagu daray 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, iyo 1 mM CuSO4 ee 1 h heerkulka qolka kor u ruxruxa.Falcelinta degdega ah ka dib, ku dar 4x Laemmli's baffer si toos ah isku dhafka oo ku kari 95°C 10 daqiiqo.Muunado ayaa lagu falanqeeyay jeelyada SDS-PAGE waxaana lagu falanqeeyay xayndaab galbeedka oo leh streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
peptide synthetic-ka ah ee histidine-ka ku jira oo leh C-terminal amidation (LHDALDAK-CONH2) ayaa loo isticmaalay in lagu falanqeeyo peptide-ku-salaysan u dhow ee calaamadaynta faylasha.Qiimayntan, 100 μM miniSOG la safeeyey, 10 mM probe 3 iyo 2 μg/ml peptide synthetic ayaa lagu qasay PBS wadarta mugga falcelinta ee 50 μl.Isku darka falcelinta waxaa lagu shiday iftiin buluug ah oo LED ah 1 saac heerkulka qolka.Hal microliter oo muunad ah ayaa la falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo nidaamka LC-MS (Biyo, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight mass spectrometer oo leh software falanqaynta MassLynx).
Unugyada HEK293T oo si adag u muujinaya hidda-wadaha isku dhafka ah ee miniSOG ayaa lagu beeray 10 sentimitir suxuuneed oo loogu talagalay khadadka leh meelaynta xubnaha kala duwan (Mito, ER, Nucleus) iyo 15 cm saxannada loogu talagalay khadadka Parkin-miniSOG iyo BRD4-miniSOG.Marka la gaaro ~90% isku darka, unugyadu hal mar ayaa lagu dhaqay HBSS, ka dibna lagu daalacday baaritaanka 3 ee HBSS 1 saac oo ah 37°C waxaana lagu iftiimiyay 10W LED buluug ah heerkulka qolka.Calaamadeynta aan lala xiriirin ee Parkin, 10 µM proton carbonyl cyanide side m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) oo leh baaritaanka 3 ee HBSS ayaa lagu daray 1 saac at 37°C.Falanqaynta unugyada, kimistariga riix, hoos u dhigista iyo tillaabooyinka alkylation waxay la mid ahaayeen kuwa kor lagu sharaxay, marka laga reebo in 2 mg of lysate lagu daray iyo biotin PEG3 azide ayaa loo adeegsaday falcelinta gujinta halkii laga heli lahaa biotin azide sawir-qaadid.Kobcinta ka dib, kuulku waxa la maydhay 3 jeer 5 ml oo PBS ah oo ka kooban 0.2% SDS, 3 jeer 5 ml oo PBS ah oo ka kooban 1 M HOL, iyo 3 jeer 5 ml oo PBS ah.Intaa ka dib, 2 µg trypsin ayaa lagu daray 300 µl 25 mM ABC oo ka kooban 1 M urea si borotiinka loo kala saaro habeenkii 37°C.Falcelinta waa la joojiyay iyadoo lagu daray formic acid ilaa pH 2-3 la gaaray.Ka dib markii la isku dayo tusbaxa, xalka peptide waa la macmalay iyadoo la isticmaalayo tiirka SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) waxaana lagu qallajiyey xooga saarista faakuumka Speedvac.Peptides ayaa dib loogu milmay 0.1% formic acid iyo 500 ng ee peptides ayaa lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo spectrometer mass Orbitrap Fusion Lumos Tribrid oo ku qalabaysan isha nano-ESI ee kor lagu sharaxay.Peptides waxaa lagu kala soocay safafka hore ee RP-HPLC ee ganacsiga (75 μm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) iyo tiirarka RP-HPLC ee falanqaynta (75 μm x 25 cm) (Thermo, no. 164941), labadaba waxaa ka buuxay 2 μm.gradient laga bilaabo 8% ilaa 35% ACN gudaha 60 daqiiqo, ka dibna toos ah ayaa kordhay ilaa 98% B 6 daqiiqo gudaheed heerka socodka 300 Nl/min.spectra MS (350-1500 m/z) ayaa lagu soo ururiyay xalinta 60,000, AGC 4 × 105, iyo wakhtiga ugu badnaan 50 ms.Iions la doortay ayaa si isdaba joog ah u kala qaybiyay HCD ee wareegyada 3 oo leh tamar isku dhac caadi ah oo ah 30%, daaqad go'doon ah oo afar geesle ah 22 ms ayaa la isticmaalay.Ka saarida firfircoon ayaa loo dejiyay 45 ilbiriqsi. Iions aan la magacaabin ama kuwa leh 1+ iyo>7+ ayaa loo diiday MS/MS. Iions aan la magacaabin ama kuwa leh 1+ iyo>7+ ayaa loo diiday MS/MS. Неназначеные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Iions ama ion aan la magacaabin oo leh 1+ iyo>7+ ayaa loo diiday MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неукаzannые Iions ama ion aan la cayimin oo lagu eedeyay 1+ iyo>7+ ayaa loo diiday MS/MS.
Tillaabooyinka diyaarinta muunadda ilaa tayeynta kuulka NeutrAvidin waxay la mid ahaayeen falanqaynta LC-MS/MS ee kor lagu sharraxay.Qiyaastii 50 μg oo lysate ah ayaa loo isticmaalay sidii gelinta xakamaynta rarka iyo 2 mg ee lysate ayaa loo isticmaalay falcelinta gujinta.Ka dib markii la kobciyo oo lagu dhaqo neutravidin, borotiinada xidhxidhan ayaa la miiray iyadoo lagu daray 50 μl oo ah kaydka Laemmli ee kuulka xabagta agarose iyo karkarinta 95 ° C. 5 daqiiqo.Kontoroolka gelinta culeyska iyo muunado tayeysan kuul ayaa waxaa falanqeeyay SDS-PAGE waxaana loo wareejiyay xuubabka PVDFXuubabka waxaa lagu xiray 5% caano duf ah (Sangon, #A600669) ee TBS oo ka kooban 0.1% tween-20 (TBST) waxaana si isdaba joog ah loogu tallaalay unugyada difaaca aasaasiga ah iyo kuwa sare.Unugyada difaaca aasaasiga ah ayaa lagu qasi jiray 1:1000 5% caano la shubay oo TBST ah waxaana lagu duray habeenkii 4°C.Unugyada difaaca jirka ee labaad ayaa loo adeegsaday saamiga 1:5000 waxaana lagu beeray 1 saac heerkulka qolka.Xuubabka waxaa lagu sawiray chemiluminescence iyadoo la adeegsanayo nidaamka sawirka Chemidoc MP.Dhammaan baaritaannada aan la jarin ee boobka iyo jel-ka ee shaxanka waxaa loo soo bandhigay xog ceeriin ah.
Unugyada aasaasiga ah ee loo isticmaalo daraasaddan waxaa ka mid ah bakaylaha anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, no. 71992), bakaylaha anti-FUS monoclonal antibody (CST, no. 67840), anti-NSUN2 polyclonal antibody (Proteintech, no. 20854-1- AP), bakaylaha anti-mSin3A polyclonal antibody (Abcam, #ab3479), mouse anti-tag monoclonal antibody (TransGen, #HT201-02), mouse anti-β-actin monoclonal antibody (TransGen, #HC201-01), bakayle antibody -CDK2 monoclonal antibody (ABclonal, #A0094), bakayle monoclonal antibody ilaa CTBP1 (ABclonal, #A11600), bakayle polyclonal antibody ilaa DUT (ABclonal, #A2901), bakayle polyclonal antibody ilaa PSMC4 (ABclonal, #A2505), bakayle anti- DNAJB1 polyclonal antibody (ABclonal, # A5504).Unugyada difaaca jirka waxa loo adeegsaday 1:1000 milil oo 5% caano dufan ah oo ku jira TBST.Unugyada difaaca sare ee loo adeegsaday daraasaddan waxaa ka mid ahaa ka hortagga bakaylaha IgG (TransGen, #HS101-01), anti-mouse IgG (TransGen, #HS201-01) at 1:5000 milil.
Si loo sii baaro in BRD4 ay la falgasho SFPQ, unugyada HEK293T iyo BRD4-miniSOG ee deggan ee HEK293T ayaa lagu dhejiyay saxamada 10 cm.Unugyada waxaa lagu maydhay PBS qabow waxaana lagu nadiifiyey 1 ml Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) oo leh EDTA-free protease inhibitor 30 daqiiqo at 4°C.Taas ka dib, lysates-yada waxaa lagu soo ururiyay 1.5 ml tuubooyinka centrifuge iyo centrifuge at 15,871 xg 10 min at 4 ° C.Daawada sare ayaa la goostay oo lagu daray 5 µg oo ka-hortagga-V5 ​​oo ku suntan mouse monoclonal antibody (CST, #80076) habeenkii oo dhan 4°C.Ku dhaq ku dhawaad ​​50 µl borotiinka A/G birta birta ah (MCE, #HY-K0202) laba jeer iyadoo PBS ay ka kooban tahay 0.5% Tween-20.Kadibna lysates-ka unuggu waxaa lagu dhex galiyay kuulo birlab ah 4 saacadood oo ah 4 ° C iyada oo la wareegaysa hoos ilaa sare.Kadib tusbaxyada waxaa lagu maydhay afar jeer 1 ml oo ah bakhaar PBST waxaana lagu karkariyey 95 ° C 5 daqiiqo.Muunado ayaa lagu falanqeeyay jeelyada SDS-PAGE waxaana loo wareejiyay xuubabka PVDF iyadoo la adeegsanayo hababka blot-galbeedka caadiga ah.Xuubabka waxaa lagu xannibay 5% caanaha dufan ee TBST waxaana si isdaba joog ah loogu tallaalay unugyada difaaca aasaasiga ah iyo kuwa sare.Antibody Rabbit anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, #71992) ayaa loo adeegsaday saamiga 1:1000 ee 5% caanaha dufan ee TBST waxaana lagu duray habeenkii 4°C.Ka-hortagga bakayle IgG waxaa loo adeegsaday saamiga 1:5000 waxaana lagu beeray 1 saac heerkulka qolka.Xuubabka waxaa lagu sawiray chemiluminescence iyadoo la adeegsanayo nidaamka sawirka Chemidoc MP.
Dhammaan qaab-dhismeedyada loo isticmaalo falanqaynta Aagga Sare ee La Heli karo (SASA) waxa laga helay Baanka Xogta borotiinka (PDB)52 ama Xogta Qaabdhismeedka Barootiinka ee AlphaFold53.Absolute SASA waxaa loo xisaabiyay hadhaaga kasta iyadoo la isticmaalayo barnaamijka FreeSASA.Kaliya dhammaystiran oo aan madmadow lahayn xogta SASA ee loogu talagalay histidine calaamadeysan iyo deriskeeda ayaa loo adeegsaday si loo helo celceliska SASA ee qaab dhismeed kasta.Helitaanka dareeraha qaraabada ah (RSA) ee histidine kasta waxaa lagu xisaabiyay iyadoo loo qaybiyay qiimaha saxda ah ee SASA inta ugu badan ee suurtogalka ah ee suurtogalka ah ee suurtogalka ah ee uu heli karo dareeraha.Dhammaan histidines ayaa markaa loo kala saaray inay yihiin kuwo qarsoon haddii celceliska RSA uu ka hooseeyo 20%, haddii kale la soo bandhigay56.
Faylasha cayriin ee lagu helay qaabka DDA ayaa la baadhay iyadoo la isticmaalayo Proteome Discoverer (v2.5) ama MSfragger (Fragpipe v15.0) ee ku habboon xogta borotiinka ee SwissProt ee la xaqiijiyay oo ay ku jiraan wasakhooyin caadi ah.peptides-ku waxa ay u baahdeen trypsin dhamaystiran oo leh laba goobood oo kala jeexan oo maqan, carbamoyl methylation oo ah wax ka beddel go'an iyo methionine oxidation oo ah beddelaad firfircoon.Dulqaadyada hore iyo jajabka miisaanka ayaa loo dejiyay 10 ppm iyo 0.02 Da (MS2 Orbitrap), siday u kala horreeyaan. Waxyeellooyinka wasakhaysan waa laga saaray, borotiinadana waa la miiray si loo helo heerka daahfurka beenta ah ee <1%. Waxyeellooyinka wasakhaysan waa laga saaray, borotiinadana waa la miiray si loo helo heerka daahfurka beenta ah ee <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфинцеть. Ku-dhufashada wasakhaysan waa la saaray oo borotiinada waa la miiray si loo siiyo heerka ogaanshaha beenta ah ee <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложнарух . Waxyeellooyinka wasakhaysan waa la saaray oo borotiinada waa la miiray si loo gaaro heer been ah oo togan oo <1%.Falanqaynta tirada iyada oo aan la isticmaalin calaamadaha, ka kooban borotiinka caadiga ah ee ka kooban saddex soo noqnoqda ayaa la isticmaalay.Falanqaynta deegaan-hoosaadka borotiinka waxaa lagu sameeyay falanqaynta Gene Ontology (GO) ee DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 iyo xog ururin oo ay daabaceen kooxda Alice Ting.Khariidadda foolkaanaha waxaa laga helay Perseus (v1.6.15.0). Isbeddellada laalaabyada borotiinka ayaa lagu tijaabiyay muhiimadda tirakoobka iyadoo la adeegsanayo t-tijaabo laba-dhinac ah, iyo hits borotiinka waxaa lagu aqoonsaday isbeddel badan> 2 (haddii aan si kale loo sheegin) iyo qiimaha p <0.05. Isbeddellada laalaabyada borotiinka ayaa lagu tijaabiyay muhiimadda tirakoobka iyadoo la adeegsanayo t-tijaabo laba-dhinac ah, iyo hits borotiinka waxaa lagu aqoonsaday isbeddel badan> 2 (haddii aan si kale loo sheegin) iyo qiimaha p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Isbeddellada laablaaban ee maadada borotiinka ayaa lagu tijaabiyay muhiimadda tirakoobka iyadoo la adeegsanayo t-tijaabo laba-dabo leh, iyo u dhigma borotiinka waxaa lagu aqoonsaday isbeddelka nuxurka>2 (haddii aan si kale loo sheegin) iyo qiimaha ap <0.05... Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Muhiimadda tirakoobka ee isbeddelada isku laabma ee borotiinka waxaa lagu tijaabiyay iyada oo la adeegsanayo t-tijaabin laba-dabo ah, iyo u dhigma borotiinka ayaa loo go'aamiyay isbeddelada content> 2 (haddii aan si kale loo sheegin) iyo p-qiimaha <0.05.Falanqaynta isdhexgalka borotiinka ayaa la sameeyay iyadoo la adeegsanayo falanqaynta GO oo ay weheliso xogta String.
Saddex nooc oo bayooloji ah ayaa la sameeyay natiijooyin isku mid ah.Falanqaynta tirakoobka waxaa lagu sameeyay GraphPad Prism (software GraphPad) iyo dhulalka volcano waxaa lagu sameeyay Perseus (v1.6.15.0).Si loo barbardhigo labada kooxood, p-qiimaha ayaa la go'aamiyay iyadoo la adeegsanayo t-tijaabka Ardayga laba-dabo leh.Kaliya borotiinnada hal-abuurka ah ee lagu aqoonsaday ugu yaraan laba jeer kooxda tijaabada ah ayaa lagu daray dhulalka volcano, iyo qiyamka maqan ee kooxda kantaroolka ayaa lagu beddelay Perseus qaybinta caadiga ah si p-qiimaha loo xisaabiyo.Baararka khaladku waxay matalaan celceliska ± weecanka caadiga ah.Falanqaynta borotiinka ee falanqaynta tirakoobka, tirada badan ee borotiinka ee ka soo muuqday ugu yaraan laba nooc oo bayooloji ah ayaa la hayaa.Hababka tirakoobka looma isticmaalin si horay loo go'aamiyo cabbirka muunadda.Tijaabooyinku maaha kuwo aan kala sooc lahayn.Cilmi-baadhayaashu ma indho la'ayn hawlaha inta lagu jiro tijaabada iyo qiimeynta natiijooyinka.
Macluumaad dheeraad ah oo ku saabsan naqshadeynta daraasadda, eeg Warbixinta Cilmi-baarista Dabeecadda ee la taaban karo ee ku xiran maqaalkan.
Xogta spectrometry-ga tirada badan ee lagu helay daraasaddan waxaa loo gudbiyay ProteomeXchange Consortium iyada oo loo sii marayo kaydka lammaanaha iProX57 ee hoos yimaada aqoonsiga dataset PXD034811 (dataset PDPL-MS).Xogta ceeriin waxaa lagu bixiyaa qaab faylal xog ceeriin ah.Maqaalkani waxa uu bixiyaa xogta asalka ah.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Barashada xaafadda: iyadoo la adeegsanayo biotinylation-ku-tiirsanaanta u-dhowaanshaha si loo asteeyo dhismooyinka borotiinka iyo khariidadaha organelles. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Barashada xaafadda: iyadoo la adeegsanayo biotinylation-ku-tiirsanaanta u-dhowaanshaha si loo asteeyo dhismooyinka borotiinka iyo khariidadaha organelles.Gingras, AS, Abe, KT iyo Raut, B. Aqoonta agagaaraha: iyadoo la adeegsanayo biotinylation-ku-tiirsanaanta u dhow si loo astaameeyo dhismooyinka borotiinka iyo khariidadaha xubnaha. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白僶誨复合物制复复合物制复受。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Fahamka xaafadda: isticmaal ku-tiirsanaanta xaafadda ee nolosha noolaha.Gingras, AS, Abe, KT iyo Raut, B. Fahamka u dhowaanshaha: sifaynta isku-dhafka borotiinka iyo khariidaynta xubnaha iyadoo la adeegsanayo biotinylation-ku-tiirsanaanta u dhow.Hadda.Fikradayda.Kiimikobayoloji 48, 44-54 (2019).
Geri, JB iyo al.Khariidaynta deegaanka yar yar adoo u wareejinaya tamarta Dexter unugyada difaaca.Sayniska 367, 1091-1097 (2020).
Hertling, EL iyo al.Shabakado laba-proteome ah ayaa ogaanaya dib-u-qaabaynta unugyada gaarka ah ee isdhexgalka aadanaha.Unugyada 184, 3022-3040.e3028 (2021).