Wararka

Waad ku mahadsan tahay booqashada Nature.com.Nooca browserka aad isticmaalayso waxa uu leeyahay taageerada CSS oo xadidan.Waayo-aragnimada ugu fiican, waxaan kugula talineynaa inaad isticmaasho browser-ka la cusboonaysiiyay (ama aad damiso Habka Laqabsiga ee Internet Explorer).Dhanka kale, si loo xaqiijiyo taageerada joogtada ah, waxaan ka dhigi doonaa goobta iyada oo aan lahayn qaabab iyo JavaScript.
Unugyada kansarku waxay abuureen habab kala duwan si ay uga gudbaan diiqada gacanta oo ay u sii wadaan horumarka.Protein kinase R (PKR) iyo firfircoonida borotiinka (PACT) ayaa ah jawaabayaasha bilowga ah ee kormeeraya calaamadaha walaaca ee kala duwan ee u horseedaya joojinta faafinta unugyada iyo apoptosis.Si kastaba ha ahaatee, nidaamka PACT-PKR ee unugyada kansarka ayaa weli ah mid aan la garanayn.Halkan, waxaan ku ogaanay in dheer oo aan codeeyn RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ay si toos ah ugu lug leedahay joojinta dariiqa PACT-PKR waxayna kor u qaadaa faafinta unugyada kansarka.Isticmaalka baaritaanka baaxadda weyn ee waxqabadka ee CRISPRi 971 kansarka la xidhiidha lncRNA, waxaan ogaanay in DARS-AS1 ay la xiriirto kororka unugyada kansarka.Sidaa darteed, DARS-AS1 knockout waxay joojisaa kororka unugyada waxayna kor u qaaddaa apoptosis unugyada kansarka ee khadadka unugyada kansarka ee kala duwan ee vitro waxayna si weyn u yareysaa korriinka burooyinka ee vivo.Farsamo ahaan, DARS-AS1 waxay si toos ah ugu xidhan tahay qaybta firfircoonida ee PACT waxayna ka hortagtaa isdhexgalka PACT-PKR, taas oo hoos u dhigaysa firfircoonida PKR, eIF2a fosforyaalka, iyo joojinta dhimashada unugyada apoptotic.Kiliinik ahaan, DARS-AS1 waxaa si weyn loogu muujiyey kansarro badan, iyo muujinta xad-dhaafka ah ee lncRNA waxay muujinaysaa saadaal liidata.Daraasadani waxay si cad u qeexaysaa qawaaniinta gaarka ah ee kansarka ee dariiqa PACT-PKR ee DARS-AS1 lncRNA waxayna bixisaa bartilmaameed kale oo saadaalinta kansarka iyo daaweynta.
Awoodda la qabsiga walaaca ayaa ah astaan ​​muhiim u ah badbaadada unugyada kansarka iyo kororka.Korodhka degdega ah iyo calaamadaha dheef-shiid kiimikaadka ee kansarka ugu sarreeya ee microevironments adag-nafaqo-yarida, hypoxia, iyo pH hoose-taasoo kicin karta waddooyinka calaamadaynta dhimashada unugyada.Habaynta hiddo-wadaha xasaasiga ah sida p535, borotiinnada shoogga kulaylka 6, 7, KRAS8, 9, iyo HIF-110, 11, 12, 13 ayaa inta badan lagu arkaa kansarka, taas oo xannibaysa apoptosis iyo kor u qaadista badbaadada.
Protein kinase R (PKR) waa dareemayaasha walaaca muhiimka ah iyo subunit kinase of eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α), nidaamiye tarjumaad ah oo isku xira cadaadiska gacanta iyo dhimashada unugyada.PKR waxaa markii hore loo aqoonsaday borotiinka ka hortagga fayraska markii la ogaaday RNA labajibbaaran oo shisheeye ah (dsRNA).Marka la dhaqaajiyo, PKR fosfooraska eIF2a si loo joojiyo isku-darka borotiinka fayraska iyo unugyada14,15,16.PACT (Protein activator PKR) ayaa loo aqoonsaday borotiinka firfircoonida PKR ee ugu horreeya maqnaanshaha dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Iyada oo si toos ah ula falgasha PKR, PACT waxay u beddeshaa cadaadisyo kala duwan (macaluul serum, peroxide ama arsenite) PKR iyo dariiqyada calaamadaha hoose.Marka lagu daro eIF2a fosforyaalka, PACT-dhexdhexaadinta PKR firfircoonida waxay kicisaa dhacdooyin kala duwan oo la xidhiidha jawaab-celinta walbahaarka, oo ay ku jiraan xaaladda redox ee la beddelay iyada oo loo marayo dariiqa PI3K/Akt24, hubinta dhaawaca DNA-ga ee la xoojiyey ee p5325,26 iyo NF-κB27,28 waxay xakameysaa qorista, 29. Marka la eego doorkooda muhiimka ah ee ka jawaab celinta walaaca, kororka, apoptosis iyo hababka kale ee muhiimka ah ee gacanta, PKR iyo PACT waxay ballanqaadayaan bartilmaameedyo daweyn oo cudurro badan, gaar ahaan kansarka30,31,32,33.Si kastaba ha ahaatee, inkastoo this pleiotropic functional iyo muhiimadda bayooloji, nidaaminta waxqabadka PACT/PKR ee unugyada kansarka ayaa weli ah mid la fahmi karo.
lncRNAs waa qoraalo ka weyn 200 nucleotide oo aan lahayn awood-koodh borotiin ah.Tan iyo markii la jeexjeexay mashaariicda isku xigxiga genome-ga oo dhan ayaa aqoonsaday kumanaan lncRNAs,35,36 dadaal badan ayaa la sameeyay si loo caddeeyo hawlahooda noole.Cilmi baaris sii kordheysa ayaa muujisay in lncRNAs ay ku lug leeyihiin habab badan oo bayooloji37 oo ay ku jiraan nidaaminta X-chromosome inactivation38,39, daabacaadda40, transcription41,42, translation43 iyo xitaa koritaanka kansarka44,45,46,47.Daraasadahan ayaa sheegay in lncRNAs badan ay ku lug leeyihiin dariiqa PACT/PKR.Mid ka mid ah daraasaddan ayaa muujisay in lncRNA ASPACT ay joojisay qoraalka PACT iyo sii-haynta nukliyeerka ee PACT mRNA.Daraasado kale ayaa muujiyay in lncRNA nc886 ay ku xidhan tahay PKR oo ay joojiso fosforyaalkeeda49,50.Ilaa hadda, lncRNA nidaaminta PACT-ku-dhexdhexaadinta PKR lama soo sheegin.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ayaa loo aqoonsaday inuu yahay lncRNA51,52,53,54.Iyada oo loo marayo nidaamka miP-194-5p53, miP-12952 iyo miP-532-3p51, DARS-AS1 ayaa lagu muujiyay inay kor u qaadayso korriinka unugyada kelyaha ee unugyada cad, kansarka tayroodh iyo kansarka sanbabada unugyada aan yareyn, siday u kala horreeyaan.Tong iyo asxaabtiisuba waxay sidoo kale ogaadeen in DARS-AS1 ay kor u qaaddo horumarka myeloma iyada oo la ilaalinayo xasilloonida borotiinka 39 (RBM39) RNA-ku-xidhanaanshaha motif.Si kastaba ha noqotee, wax daraasado ah laguma sameynin in lncRNA-kan uu ku lug leeyahay nidaaminta firfircoonida PACT-PKR iyo jawaabta walaaca ee unugyada kansarka.
Halkan, waxaan ku sameynay shaashad shaqo oo weyn oo lumis ah iyadoo la adeegsanayo nidaamka CRISPRi waxaana go'aaminnay in DARS-AS1 lncRNA ay kor u qaaddo faafinta dhowr nooc oo unugyada kansarka ah.Intaa waxaa dheer, waxaan aqoonsannay hab weyn: DARS-AS1 waxay si toos ah ugu xiran tahay PACT, waxay joojisaa PACT iyo PKR xidhitaanka, waxay ka hortagtaa fosforyaalka eIF2a, substrate hoose ee PKR, ugu dambeyntii waxay joojisaa dhimashada unugyada apoptotic.Gebogebadii, shaqadeenu waxay daaha ka qaadaysaa DARS-AS1 lncRNA oo ah maamule dariiqa PACT-PKR iyo bartilmaameedka suurtagalka ah ee daaweynta kansarka iyo saadaasha.
Baadhitaano xog-ururineed oo ballaadhan ayaa aqoonsaday boqollaal lncRNA-yada la xidhiidha kansarka.Si kastaba ha ahaatee, shaqadoodii ayaa weli ah mid aan la garanayn56.Si loo aqoonsado musharraxiinta lncRNA ee ballan-qaadka ah ee ku lug leh horumarka kansarka, waxaanu samaynay shaashad-shaqo lumis ah oo loogu talagalay hoos u dhigista kororka unugyada kansarka mindhicirka ee SW620 iyadoo la adeegsanayo nidaamka CRISPRi (Jaantus. 1a).Tilmaamaha gaarka ah ee SW480 iyo SW620 ee khadadka unugyada kansarka mindhicirka waa inay ka soo jeedaan burooyinka asaasiga ah iyo kuwa sare ee hal bukaan.Tani waxay siinaysaa isbarbardhig qiimo leh oo lagu baranayo isbeddellada hidde-sideyaasha ee horumarka kansarka mindhicirka sare.Sidaa darteed, waxaanu falanqeynay qoraalada xargaha unugyada kansarka mindhicirka (SW480 iyo SW620) anagoo adeegsanayna isku xigxiga RNA waxaanan ka soo ururinay qaar ka mid ah lncRNAs shaqayn kara suugaanta la daabacay.Iyada oo ku saleysan natiijooyinkaan, waxaan naqshadeynay maktabad sgRNA la isku daray oo ka kooban 7355 sgRNA oligos oo lagu beegsanayo 971 lncRNAs-la xiriira kansarka iyo 500 sgRNA oligos aan la beegsan oo xakameyn taban (Xogta Dheeraadka 1).
Matalaadda naqshadaynta ee baadhista iyadoo la isticmaalayo nidaamka CRISPRi.b sgRNA kobcinta baaritaanka ka dib.Xariiqda dhibicda toosan waxay u taagan tahay log2 (la laablaabashada) = ± 0.58.Xariiqda dhibcaha toosan waxay tilmaamaysaa qiimaha p = 0.05.Dhibcaha madow waxay ka dhigan yihiin sgRNA aan bartilmaameed ahayn (oo loogu talagalay NC).Dhibcaha cas waa sgRNAs bartilmaameedsanaya DARS-AS1.Dhibcaha buluuga ah waa sgRNAs beegsanaya LINC00205, oo hore loogu sifeeyay lncRNA oncogenic.laablaabasho = (akhris caadi ah, maalinta 17)/(akhris caadi ah, maalinta 0).c DARS-AS1 sgRNA garaacista waxay joojisay koritaanka unugyada.Baararka khaladku waxay matalaan ± weecanka caadiga ah ee saddexda tijaabo.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 Imtixaanka Ardayga laba-dabo leh.d DARS-AS1 muujinta burooyinka (TCGA dataset).em Muujinta DARS-AS1 ee lammaaneyaasha caadiga ah iyo muunadaha burooyinka ee bukaannada qaba BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, iyo COAD, siday u kala horreeyaan (TCGA dataset).p-qiimaha ayaa lagu helay iyadoo la isticmaalayo t-tijaabka Ardayga laba-dabo leh.
Ka dib markii aan dhisnay plasmid-ka oo aan baakadnay lentivirus-ka, waxaanu ku beddelnay khadka unugyada kansarka mindhicirka ee dCas9-SW620 maktabadda sare ee afar tijaabo oo caabuq oo madaxbannaan.Badnaanta caabuqa (MOI) ee caabuqyadani waxay ahayd 0.1-0.3, taas oo muujinaysa in unug kasta lagu qaadi karo hal sgRNA oo keliya.Ka dib 18 maalmood ee dhaqanka in vitro, astaanta kobcinta ee sgRNA-yada ayaa hoos u dhacay ama kordhay baaritaanka ka dib, halka tirada xakamaynta oligonucleotides ee aan la beegsanayn ay weli tahay mid aan isbeddelin marka la barbardhigo astaanta hore ee baaritaanka, taas oo muujinaysa in bartilmaameedkayadu uu leeyahay shaashad gaar ah oo heer sare ah. maktabad.Bariis1b iyo miiska dheeriga ah 1). LINC00205, oo hore loo soo sheegay si kor loogu qaado kansarka sanbabada iyo horumarka kansarka beerka58,59,60, ayaa la baadhay (log2 (la laabmay) <-0.58, p qiimaha <0.05), taasoo xaqiijinaysa kalsoonida baadhistan (Jaantus. 1b). LINC00205, oo hore loo soo sheegay si kor loogu qaado kansarka sanbabada iyo horumarka kansarka beerka58,59,60, ayaa la baadhay (log2 (la laabmay) <-0.58, p qiimaha <0.05), taasoo xaqiijinaysa kalsoonida baadhistan (Jaantus. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, oo hore loo soo sheegay si kor loogu qaado horumarka kansarka sanbabada iyo kansarka beerka58,59,60, ayaa laga saaray (log2 (lalaab isbedel) <-0.58, p-qiimaha <0.05), oo xaqiijinaya adkeynta baaritaankan (Jaantus. 1b) . LinC 肺癌 肺癌 和 进展 进展 促进 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 58qow, 筛 筛 选 掉 (log2 (倍数 变化) <-0.58, p 值 <0.05), 证实 了 该 该 筛选 筛选 筛选该 的 可靠性 (图 (图 (图 (图 (图 该 该 该 该 筛选 筛选 的. LinC 肺癌 肺癌 和 进展 进展 促进 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 58qow, 筛 筛 选 掉 (log2 (倍数 变化) <-0.58, p 值 <0.05), 证实 了 该 该 筛选 筛选 筛选该 的 可靠性 (图 (图 (图 (图 (图 该 该 该 该 筛选 筛选 的. LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, oo hore loo soo sheegay si kor loogu qaado horumarka kansarka sambabada iyo beerka58,59,60, ayaa laga saaray (log2 (laab beddelka) <-0.58, p-qiimaha <0.05), oo xaqiijinaya adkaynta baaritaankan (Jaantus. .1b).
Dhammaan lncRNA-yada la tijaabiyay, DARS-AS1 ayaa sidoo kale la baaray, iyadoo saddexda cognate sgRNA oligonucleotides ay si weyn hoos ugu dhacday ka dib 18 maalmood oo dhaqameed, taas oo soo jeedinaysa in garaacista lncRNA ay keentay hoos u dhaca kansarka (Jaantus. 1b).Natiijadan waxaa lagu sii taageeray falanqaynta MTS ee unugyada kansarka mindhicirka oo muujinaya in heerka korriinka ee DARS-AS1 unugyada garaaca ay kala badh kaliya ka yaraadeen marka la barbardhigo unugyada kantaroolka (Jaantus 1c) waxayna la socotaa warbixinadii hore ee dhowr nooc oo kansar ah.: kansarka kelyaha unug cad, kansarka tayroodhka iyo kansarka sambabada unugyada aan yarayn51,52,53,55.Si kastaba ha ahaatee, shaqadeeda iyo hababka molecular ee kansarka mindhicirka ayaan weli la sahamin.Sidaa darteed, waxaan u dooranay lncRNA kan daraasad dheeri ah.
Si loo barto muujinta DARS-AS1 ee bukaanka, waxaanu si buuxda u falanqeeyay 10,327 muunado burooyin ah oo laga soo qaaday mashruuca Kansarka Genome Atlas (TCGA).Natiijooyinkayagu waxay muujinayaan in DARS-AS1 si ballaaran loo muujiyay oo si weyn loo hagaajiyay unugyada caafimaadka qaba ee noocyo kala duwan oo burooyin ah, oo ay ku jiraan adenocarcinoma colon adenocarcinoma (COAD), kansarka unugyada unugyada cad ee kelyaha (KIRC), iyo kansarka unugyada papillary cell (KIRP)..Aad u yar (Jaantuska 1d iyo Sawirka Dheeraadka ah 1a, b). Falanqaynta shaybaarada caafimaadka ee lammaanaha ah ayaa sii xaqiijiyay muujinta DARS-AS1 ee burooyinka kaadiheysta kaadiheysta kansarka kaadiheysta (BLCA), kansarka kelyaha ee unugyada cad ee kelyaha (KIRC), adenocarcinoma prostate (PRAD), kansarka sanbabada unugyada squamous (LUSC) , Uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), adenocarcinoma sambabada (LUAD), kansarka beerka hepatocellular (LIHC), kelyaha kelyaha papillary cell carcinoma (KIRP), iyo adenocarcinoma colon (COAD) (p qiimaha <0.05) (Fig. 1e-m) . Falanqaynta shaybaarada caafimaadka ee lammaanaha ah ayaa sii xaqiijiyay muujinta DARS-AS1 ee burooyinka kaadiheysta kaadiheysta kansarka kaadiheysta (BLCA), kansarka kelyaha ee unugyada cad ee kelyaha (KIRC), adenocarcinoma prostate (PRAD), kansarka sanbabada unugyada squamous (LUSC) , Uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), adenocarcinoma sambabada (LUAD), kansarka beerka hepatocellular (LIHC), kelyaha kelyaha papillary cell carcinoma (KIRP), iyo adenocarcinoma colon (COAD) (p qiimaha <0.05) (Fig. 1e-m) .Falanqaynta shaybaarada caafimaadka ee lammaanaha ah ayaa sidoo kale xaqiijiyay muujinta DARS-AS1 ee kansarka kaadiheysta kaadiheysta kaadiheysta kaadiheysta kaadiheysta kaadiheysta kaadiheysta (BLCA), kansarka unugyada unugyada cad ee kelyaha iyo unugyada kelyaha (KIRC), adenocarcinoma prostate (PRAD), kansarka sanbabada unugyada squamous (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) Kansarka endometrial ee ilmagaleenka corpus uteri (UCEC), adenocarcinoma sambabada (LUAD), kansarka beerka hepatocellular ee beerka (LIHC), kansarka unugyada papillary ee kelyaha (KIRP), iyo adenocarcinoma ee xiidmaha (COAD) (p qiimaha < 0.05) (Jaantuska 1e- m) .配对更 高 表达, 子宫体子宫 内膜 癌 (UCEC), 肺腺癌 (ucec), 肺腺癌 (luad), 肝肝 细胞癌 (lihc), 肾 肾 乳头状 细胞癌 细胞癌 (krp) 和结肠腺癌 (p 值) <0.05) (1e-m) .对 对(LUSC) 肿瘤 的 的 中中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 表达 表达更, 内膜 癌 ((Ucel) 肺腺癌 (LUAD) 肝肝 细胞癌 (lihc) 肾 乳头状 细胞 细胞 乳头状 乳头状癌 (kirp) (coad) （p 值 <0.05） (图1e-m) .Falanqaynta muunado lamaanan ah oo caafimaad qaba / buro ayaa sii taageeray doorka DARS-AS1 ee kansarka kaadiheysta kaadiheysta (BLCA), kansarka unugyada kelyaha ee cad (KIRC), adenocarcinoma prostate (PRAD), iyo kansarka sanbabada unugyada squamous (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). muujinta kansarka uterineine corpus (UCEC), adenocarcinoma sambabada (LUAD), kansarka hepatocellular (LIHC), kansarka kelyaha papillary cell (KIRP), iyo adenocarcinoma colon (COAD) (p qiimaha <0.05) (Jaantuska 1e -m).Isku soo wada duuboo, natiijooyinkani waxay muujinayaan in DARS-AS1 si ballaaran oo aad loogu muujiyay noocyo kala duwan oo kansar ah.
Sababtoo ah DARS-AS1 iyo DARS ( hiddo-wadaha ku dhejinaya xargaha antisense) waxay wadaagaan isla dhiirrigeliye waxayna ku yaalliin midba midka kale, waxaan u qaabaynnay shRNA inay si gaar ah u garaacdo DARS-AS1 laakiin maaha DARS .Marka lagu daro SW620, waxaan sidoo kale isticmaalnay seddex xarriiqo unug oo kale oo si aad ah u muujinaya DARS-AS1 si aan u barano waxtarka iyo shaqada garaacista shRNA (Shaxda Dheeraadka ah 3).Natiijooyinkayagu waxay muujiyeen in dhammaan saddexda shRNAs ee la sameeyay ay gaadheen ugu yaraan 80% DARS-AS1 hufnaanta garaacista iyadoo saameyn yar ku leh qadarka DARS mRNA (Jaantuska Dheeraadka ah. 2c-f).Intaa waxaa dheer, waxaan ogaanay in DARS-AS1 garaacista shRNA-yadan ay si weyn u joojiyeen koritaanka unugyada khadadka unugyada kansarka mindhicirka SW620 (49.7%) iyo HCT116 (27.7%), khadka unugyada kansarka naaska MBA-MD-231 (53.4%).) iyo xariiqda unugyada hepatoma HepG2 (92.7% dhimis), iyo sidoo kale awooddooda inay sameeyaan goobo aan la isku xirin (celcelis ahaan hoos u dhaca ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% iyo 75.7% per line cell) (Jaantus 2a,b).SW620, natiijadii qiimaynta samaynta gumaysigu waxay sii xaqiijiyeen in DARS-AS1 shRNA ay si weyn u joojisay kororka unugyada iyada oo celcelis ahaan hoos u dhac ku yimid ku dhawaad ​​69.6% (Jaantus. 2c).
Saamaynta xakamaynta shRNA iyo DARS-AS1 shRNA ee koritaanka unugyada (a) iyo samaynta spheroid (b) ee SW620, HCT116, MBA-MD-231, iyo unugyada HepG2.c Saamaynta xakamaynta shRNA iyo DARS-AS1 shRNA ee samaynta gumaysiga ee unugyada SW620.Kordhinta unugyada (d), samaynta spheroid (e), iyo samaynta gumaysiga (f) ee unugyada SW620 oo si xad dhaaf ah u muujinaya DARS-AS1.Xogta la muujiyey ayaa ah celceliska ± weecis heerka saddex tijaabo.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, iyo *** p ≤ 0.001 by t-imtixaanka ardayga laba-dabo leh.
Si loo dhamaystiro daraasadaha shaqada ee lumay, waxaanu ku xiga abuurnay unugyada SW620 oo si xad dhaaf ah u muujinaya DARS-AS1 (Jaantuska Dheeraadka ah. 2g).DARS-AS1 xad dhaafka ah ayaa si weyn u kordhay kobaca unugyada (1.8-laab), samaynta spheroid aan la xidhin (1.4-laab), iyo samaynta gumeysiga (3.3-laab) ee unugyada SW620 (Jaantus 2d-f).Waxaan xaqiijinay natiijadan anagoo adeegsanayna DARS-AS1 kale oo muujinaya xariiqda gacanta, A549.Korodhkan unugyada la xoojiyay sababtoo ah DARS-AS1 xad-dhaaf ah ayaa lagu sii arkay unugyada A549 (Jaantuska Dheeraadka ah. 2h, i iyo Jadwalka Dheeraadka ah 3).Isku soo wada duuboo, faa'iidada iyo daraasaadkan khasaaraha ayaa muujinaya in DARS-AS1 ay kor u qaaddo kororka unugyada kansarka ee vitro.
Si loo sahamiyo habka hoose ee DARS-AS1 ay ku xakameyso kororka unugyada, waxaanu samaynay falanqaynta RNA hoos u dhigista si loo aqoonsado la-hawlgalayaasheeda ku xidhan borotiinka.Natiijooyinka RT-qPCR waxay muujiyeen in qiyaastii 86.2% DARS-AS1 ay ku yaalliin cytoplasm ee unugyada SW620 (Jaantuska Dheeraadka ah. 3a).In vitro-ku-qoray biotinylated DARS-AS1 ama pseudoRNA ayaa markaa lagu darey unugyada SW620 oo ay ku xigto kala-soocidda SDS-PAGE.Midabaynta qalinka ee xigtay waxay muujisay in koox gaar ah (~ 38 kDa) si weyn loogu hodmay DARS-AS1 muunadaha jiidista laakiin aan ku jirin muunadaha RNA ama muunadaha kuul (Jaantus. 3a).Kooxdan waxaa loo aqoonsaday inay tahay PKR activating protein (PACT) by mass spectrometry (MS) waxaana sii xaqiijiyay difaaca jirka ee SW620, HCT116, iyo HepG2 khadadka unugyada (Jaantus. 3a,b).Kobcinta DARS iyo borotiinnada PACT ee la xidhiidha - PKR iyo TRBP - ayaa sidoo kale lagu baaray iyada oo la adeegsanayo falanqaynta RNA ee Western blotting (WB).Natiijooyinku waxay muujiyeen in aan la helin isdhexgalka tooska ah ee u dhexeeya DARS-AS1 RNA iyo saddexdan borotiin (Jaantuska Dheeraadka ah. 3b).Isdhexgalka gaarka ah ee u dhexeeya DARS-AS1 iyo PACT ayaa lagu sii xaqiijiyay falanqaynta RNA immunoprecipitation (RIP), taas oo muujisay in DARS-AS1 ay si weyn u xoojisay unugyada anti-PACT laakiin maaha RNA-yada kale ee kantaroolka (Jaantuska 3c).Si loo go'aamiyo haddii DARS-AS1 ay si toos ah ula falgasho PACT iyada oo ay maqan yihiin qaybaha kale ee gacanta, baaritaanka in vitro biolayer interferometry (BLI) ayaa la sameeyay iyadoo la adeegsanayo PACT la nadiifiyay.Biotin-ku calaamadeeyay DARS-AS1 ama dummy RNA ayaa lagu dhaqaajiyay biosensors streptavidin (SA) ka dibna waxaa lagu dhex daaray kaydka kinetic oo ka kooban 1 μM PACT.Gaar ahaan, PACT waxay si adag ugu xidhan tahay DARS-AS1 (Qiimaha KD ~26.9 nM), laakiin maaha inay ku ekaato RNA (Jaantuska 3d).Isku soo wada duuboo, natiijooyinkani waxay muujinayaan is-dhexgal toos ah iyo xidhiidh sare oo u dhexeeya DARS-AS1 iyo PACT.
Falanqaynta jiidashada RNA ayaa lagu aqoonsaday DARS-AS1 la falgalka PACT ee unugyada SW620.Xagga sare, wasakhaynta qalinka ee borotiinnada la xidhiidha.Immunoblots hoose ayaa lagu sameeyay anti-PACT antibody.Falanqaynta hoos-u-dhaca RNA waxaa lagu sameeyay HCT116 (sare) iyo HepG2 (hoose) unugyada.Kobcinta PACT waxaa lagu ogaaday difaaca jirka.CRNA immunoprecipitation (RIP) ayaa lagu sameeyay unugyada SW620 iyadoo la adeegsanayo unugyada difaaca jirka ee la tilmaamay.d Curyaaminta PACT ee dhererka buuxa ee DARS-AS1 ama xakamaynta RNA ayaa la helay iyadoo la isticmaalayo interferometry biolayer (BLI).RNA waxa lagu dhaqaajiyay biosensor streptavidin.1 μM PACT ayaa loo isticmaalay in lagu cabbiro ururka.e RNA jiidashada tijaabada waxaa lagu sameeyay iyadoo la isticmaalayo biotinylated dherer buuxa DARS-AS1 ama la jarjaray (sare).Immunoblot muujinaya PACT la helay (hoose).PACT la safeeyey oo la safeeyey ayaa lagu darey daars-AS1 oo dhererkiisu dhan yahay biotinylated ama la jarjarey (sida e) baaritaanka gudaha vitro RIP.RNA la soo saaray waxaa xaqiijiyay RT-qPCR.g Xidhiidhka qaraabada ee jajabyada RNA ee kala duwan ee PACT waxaa lagu helay iyadoo la isticmaalayo interferometry biolayer.Falanqaynta, 100 nM RNA iyo 1 μM RAST ayaa la isticmaalay.h In vitro RIP asaysyada waxaa lagu sameeyay iyadoo la isticmaalayo sifaysan sifaysan ama go'an oo calaamadeysan PACT.RNA la soo saaray waxaa xaqiijiyay RT-qPCR.i Heerka kobaca unugyada SW620 oo si xad dhaaf ah u muujinaya DARS-AS1, PACT, ama labadaba.Si xad dhaaf ah oo dhererkiisu dhan yahay ama go'ay DARS-AS1 ee unugyada SW620 ayaa saameyn kala duwan ku yeeshay koritaanka unugyada.Apoptosis waxaa lagu ogaadey difaac difaac oo leh anti-PARP.l garaacida DARS-AS1 waxay keentaa apoptosis ee unugyada SW620 sida lagu muujiyay cytometry socodka.Xogta la muujiyey ayaa ah celceliska ± weecis heerka saddex tijaabo. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, oo ay qaadayso imtixaan laba-dabo leh oo arday ah. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, oo ay qaadayso imtixaan laba-dabo leh oo arday ah. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 p *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 by t-tijaabka ardayda laba-dabo leh. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001,通过双尾学生t 检验。 * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001,通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 by t-tijaabka ardayda laba-dabo leh.
Ka dib waxaanu soo saarnay saddex qaybood oo biotinylated DARS-AS1 RNA ah oo lagu soo qoray vitro si loo aqoonsado gobolka DARS-AS1 ee looga baahan yahay ururka PACT (Jaantuska 3e).Natiijooyinka falanqaynta RNA waxay muujiyeen in jajab kastaa awood u yeeshay inuu la falgalo PACT, laakiin gobolka 3'-terminal (384-768 nucleotides calaamadeysan A3) ayaa muujiyay in ka badan 1-384 nucleotides oo lagu calaamadiyay A1) (Jaantus 3e).Natiijooyin la mid ah ayaa lagu arkay in vitro RIP assay iyadoo la isticmaalayo dib-u-habaynta PACT (Jaantuska 3f).Iyadoo la raacayo natiijooyinkan, tijaabooyinka lagu xirayo jajabyada RNA ee aan dhaqdhaqaaqa lahayn ee PACT iyadoo la adeegsanayo BLI waxay sidoo kale muujisay in PACT ay leedahay xiriir sare oo A3 (384-768 nt) (Qiimaha KD ee ku dhawaad ​​​​94.6 nM), halka ku dhawaad ​​​​aan la xiriirin meelaha kale.(Jaantuska. 3d).
Waxaan sidoo kale baarnay gobollada ku xiran ee PACT.PACT waxay ka kooban tahay saddex qaybood oo shaqaynaysa, laba ka mid ah kuwaas oo la dhawray laba-jibbaaran RNA-binding domains (dsRBD) iyo qaybta saddexaad (loo qoondeeyey D3) kaas oo u shaqeeya sidii firfircoone isdhexgalka borotiinka.Si loo baadho awoodda isku xidhka lncRNA ee xayndaab kasta, waxaanu farsamaynnay saddex isbeddel oo meesha ka saaray mid kasta oo ka mid ah saddexda goobood oo aanu samaynay tijaabo RIP ah oo gudaha ah.Natiijooyinkayagu waxay muujiyeen in tirtirka qaybta saddexaad (D3) ee PACT ay si weyn hoos ugu dhigtay isdhexgalka DARS-AS1 (0.11-laab marka la barbar dhigo PACT aan sax ahayn) marka la barbardhigo labada kale ee isbeddelka (Jaantus. 3h), waxaa la muujiyay in la sii daayo ee D3 ayaa la falgalay DARS.-AC1.Isku soo wada duuboo, natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in isdhexgalka ka dhexeeya DARS-AS1 iyo PACT ay dhici karto inay ugu horrayn ku dhacaan 3′ dhamaadka DARS-AS1 iyo qaybta D3 ee PACT.
Waxaan ogaanay in DARS-AS1 aysan wax saameyn ah ku laheyn muujinta PACT iyo PACT wax saameyn ah kuma yeelan DARS-AS1 (Jaantuska Dheeraadka ah. 3c).Waxaan ka dib baarnay saameynta PACT garaacista ee koritaanka unugyada.Si ka duwan DARS-AS1, unugyada qaraabada ah ayaa koray 1.5-3 jeer dhakhso ah markii PACT la garaacay (Jaantuska Dheeraadka ah 3d).Natiijooyinka qiimaynta samaynta gumaysigu waxay muujiyeen in unugyadu ay samaysteen 2-3-laab kolonyo ka dib daawaynta shRNA ee PACT (Jaantuska Dheeraadka ah 3e).Si loo tijaabiyo in DARS-AS1 ay maamusho kororka unugyada iyada oo loo marayo PACT, waxaan soo saarnay unugyada SW620 oo si xad dhaaf ah u muujinaya PACT, DARS-AS1, ama labadaba.Muujinta xad dhaafka ah ee PACT waxay muujisay xannibaad weyn oo ku saabsan kororka unugyada (Jaantuska 3i).Iyadoo DARS-AS1 xad dhaafka ah ee per se ay si weyn u kor u qaaday kororka unugyada, ma jirin farqi weyn oo u dhexeeya heerka koritaanka unugyada xad-dhaafka ah DARS-AS1 iyo PACT.Natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in PACT laga yaabo inay ka hortagto kororka kororka ee ay keento DARS-AS1 xad dhaafka ah.
Maaddaama gobollada kala duwan ee DARS-AS1 ay leeyihiin awoodo isku xira PACT oo kala duwan, waxaan baarnay saameynta ay ku leeyihiin faafitaanka unugyada iyadoo la adeegsanayo xad dhaafka kala duwan ee jajabyada DARS-AS1.Marka la barbardhigo labada jajab ee kale, DARS-AS1 ayaa si xad dhaaf ah loo muujiyay dhamaadka 3' (384-768 nt), gobolka ugu muhiimsan ee PACT ee DARS-AS1, kaas oo lahaa awoodda ugu sareysa ee lagu kicinayo kororka unugyada (Jaantus. 3j).Natiijooyinkani waxay muujinayaan xidhiidh togan oo u dhexeeya awoodda isku xidhka iyo shaqada bayooloji ee DARS-AS1.
PACT ayaa lagu soo warramey inay tahay borotiinka pro-apoptotic19.Sidaa darteed, waxaan baarnay saameynta DARS-AS1 ee apoptosis.Sidii la filayay, garaacista DARS-AS1 waxay si weyn u kordhisay kala-goynta PARP ee unugyada SW620 waxayna kordhisay saamiga unugyada V-positive annexin ee SW620, HCT116, HepG2, iyo MBA-MD-231 khadadka unugyada (Jaantus 3k).3).3f-h), taas oo muujinaysa in saameynta anti-apoptotic ee DARS-AS1 ee unugyada kansarka ay ka soo horjeedaan shaqada apoptosis-ku-abuurista ee PACT.Isku soo wada duuboo, natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in habka DARS-AS1 ee shaqada oncogenic ay noqon karto iyada oo la xakameynayo shaqada PACT.
Marka xigta, waxaanu sahminay saamaynta shaqayneed ee ururka DARS-AS1-PACT.PACT ayaa la sheegay in ay dhaqaajiso PKR iyada oo loo marayo is dhexgalka tooska ah, kaas oo markii dambe wanaajinaya eIF2a fosforyaalka, taasoo keenaysa tirtirka tarjumaada iyo apoptosis17.Marka hore, waxaanu baarnay in DARS-AS1 ay saamayso meelaynta gacanta ee PACT iyo PKR.Mikroskoobyada Confocal fluorescence waxay muujisay in PACT iyo PKR ay si aad ah u midabeeyeen unugyada SW620 oo leh celceliska isku xidhka Pearson ee 0.72.Dhanka kale, DARS-AS1 xad dhaafka ah ayaa si weyn hoos ugu dhigay PACT iyo PKR wada-meelayn (macnaha isku xidhka Pearson 0.61) (Jaantuska 4a).Si loo baaro in DARS-AS1 ay wax ka beddeli karto is dhexgalka PACT-PKR, waxaanu samaynay tijaabo is-difaacid (co-IP) oo leh anti-PACT antibody ee unugyada SW620.PKR ayaa si aad ah loogu hodmay anti-PACT ee unugyada kantaroolka, halka soo kabashada PKR ay si weyn hoos ugu dhacday lysates unugyada xad dhaafka ah ee DARS-AS1 (Jaantus. 4b).La safeeyey ee summadaysan PACT iyo PKR ayaa loo isticmaalay qiimaynta xidhidhiyaha borotiinka.Sidaa darteed, kuwa bixiyay DARS-AS1 laakiin aan xakameyn RNA waxay muujisay is dhexgalka PACT-PKR la xakameeyey (Jaantuska 4c).Natiijooyinka oo dhami waxay muujiyeen in DARS-AS1 ay carqaladeeyeen xidhiidhka PACT iyo PKR.
Isku-dubarid PACT iyo PKR ee unugyada kantaroolka ama unugyada xad-dhaafka ah ee DARS-AS1 ayaa lagu arkay iyada oo la adeegsanayo microscopy-ka konfocal fluorescence.Nuclei-yada waxaa lagu sumeeyay DAPI.Natiijooyinka tirakoobka ayaa laga helay 16 sawir.b Co-immunoprecipitation (co-IP) iyadoo la isticmaalayo anti-PACT antibody ee unugyada lysates-ka ee xakamaynta unugyada SW620 ama unugyada si xad dhaaf ah u muujinaya DARS-AS1.c calaamadeysan PACT, PKR la safeeyey oo lagu qoray gudaha vitro oo leh DARS-AS1 ama mock RNA ayaa lagu darey falanqaynta xiritaanka borotiinka in vitro.Ka-hortagga calan-ka-hortagga ayaa loo isticmaalay is-difaaca jirka.d Immunoblots leh unugyada difaaca jirka ee la tilmaamay ayaa lagu sameeyay unugyada SW620 iyo HCT116 oo lagu wareejiyay shRNA ama DARS-AS1-shRNA oo ay ku xigto serum gaajo.e DARS-AS1 heerarka muujinta waxay beddeleen dareenka gacanta ee thapsigargin.Unugyada SW620 waxaa lagu beddelay DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 plasmid xad dhaaf ah ama kontoroolka plasmid.Unugyada waxaa lagu daaweeyay thapsigargin 48 saacadood waxaana la go'aamiyay jiritaanka unugga iyadoo la isticmaalayo reagent MTS.f In vitro lagu qoray DARS-AS1 ama dummy RNA iyo PACT la safeeyey ayaa loo isticmaalay tijaabinta firfircoonida faytiyaha iyo ogaanshaha difaaca jirka.g Immunobot-yada isticmaalaya unugyada difaaca jirka waxaa lagu sameeyay unugyada SW620-ctrl (bidix) ama unugyo si xad dhaaf ah u muujinaya mutants PKR (midig).Unugyadan ayaa markaa lagu beddelay xakamaynta shRNA ama DARS-AS1-shRNA oo ay ku xigto gaajo serum.h Cytometry socodka qulqulka ayaa muujiyay in firfircooni la'aanta PKR mutant ay magdhow u tahay DARS-AS1 apoptosis-ku-abuuray unugyada SW620.Immunoblots leh unugyada difaaca jirka ee la tilmaamay ayaa lagu sameeyay unugyada SW620 (bidix) ama HCT116 (midig).Unugyada lagu kala qaado shRNA-ga ama DARS-AS1 shRNA waa serum-la'aan waxaana lagu kabay 100 nM PKR C16 inhibitor ama DMSO.Qiyaasta bar = 5 µm.Xogta la muujiyey ayaa ah celceliska ± weecis heerka saddex tijaabo.* p ≤ 0.05 t-tijaabka Ardayga laba-dabo leh.
Waxaa guud ahaan la rumeysan yahay in marka PACT ay la falgasho PKR17, fosforyaalka PKR ee Thr451 la kicin karo.Natiijooyinkayagu waxay muujiyeen in heerka fosforyaalka PKR uu si weyn kor ugu kacay DARS-AS1 unugyada garaaca ka dib gaajo serum (Jaantus. 4d iyo Sawirka Dheeraadka ah 4a).Sidaa awgeed, waxaan ogaanay in fosforyaalka eIF2a, substrate-ka ugu weyn ee PKR, uu sidoo kale si weyn u kordhay DARS-AS1 shRNA (Jaantus. 4d iyo Sawirka Dheeraadka ah. 4a).Thapsigargin waa cadaadis ER oo keena in ER uu sii daayo Ca2+.Daaweynta thapsigargin ayaa lagu soo warramey in ay kiciso muujinta iyo kicinta PACT, taas oo si dheeraad ah ula falgasha oo dhaqaajisa PKR, taasoo keenta apoptosis iyada oo la kordhinayo eIF2a fosfooraska 18,61.Halkan, waxaan u isticmaalnay thapsigargin sidii kicinta dariiqa PACT/PKR si aan u baarno bal in DARS-AS1 ay ka caawin karto unugyada inay ka gudbaan diiqada iyagoo joojinaya dariiqa PACT/PKR.Waxaan aragnay in heerka muujinta DARS-AS1 ay si togan ula xiriirto iska caabbinta unugga ee thapsigargin.Unugyada SW620 ee si xad dhaaf ah u muujinaya DARS-AS1 ayaa si fiican uga badbaaday markii lagu daaweeyay thapsigargin, halka unugyada leh DARS-AS1 garaacid ay noqdeen kuwo aad u nugul (Jaantus. 4e).Iyadoo la raacayo natiijooyinkan, DARS-AS1 xad dhaafka ah ayaa hoos u dhigay thapsigargin-ku-abuuray fosforyaalka PKR (Jaantuska Dheeraadka ah. 4b).Taas bedelkeeda, ka dib daawaynta thapsigargin, PKR iyo eIF2a waxay ahaayeen fosfooraska ilaa xad sare oo ka mid ah unugyada garaaca ee DARS-AS1 marka la barbardhigo unugyada kantaroolka (Jaantuska Dheeraadka ah 4b).Waxa xiiso leh, thapsigargin waxay kicisay DARS-AS1 muujinta qiyaasta qiyaasta, taas oo muujin karta shaqada ka hortagga cadaadiska DARS-AS1 (Jaantuska Dheeraadka ah. 4c).Intaa waxaa dheer, waxaanu samaynay imtixaanada firfircoonida ee vitro si loo xaqiijiyo indha-indhayntan.Si kooban, PKR waxaa laga sifeeyay unugyada unugyada iyadoo la adeegsanayo anti-PKR antibody, ka dibna lagu daray dib-u-habaynta PACT iyo DARS-AS1 oo lagu qoray vitro.Falcelinta enzymatic ka dib, phospho-PKR ayaa la ogaaday iyadoo la isticmaalayo WB.Natiijooyinkayagu waxay muujiyeen in fosforyaalka PKR ay si weyn u joojiyeen DARS-AS1, laakiin ma aha xakamaynta RNA (Jaantuska 4f).Natiijooyinka ku jira vitro iyo in vivo waxay soo jeedinayaan in DARS-AS1 ay joojiso PACT-dhexdhexaadinta firfircoonida PKR.Isla mar ahaantaana, waxaan sidoo kale aragnay hoos u dhaca soo kabashada PACT ee joogitaanka DARS-AS1 (Jaantus 4f).Natiijadu waxay la socotaa natiijooyinka baaritaanka isku xidhka borotiinka ee vitro (Jaantuska 4c) oo haddana waxay muujinaysaa shaqada xannibista ee DARS-AS1 ee ururka PACT-PKR.
Ser246 iyo Ser287 ee qaybta D3 ee PACT ayaa looga baahan yahay firfircoonida PKR ee hoos yimaada cadaadiska gacanta.Beddelka laba serine oo hadhaaga ah ee alanine waxa ay siisay mutant PACT (mutD), kaas oo dhaqaajiyay PKR maqnaanshaha walbahaarka, iyo badalida alanine (mutA) ayaa rogtay nidaamkii.Tan iyo markii aan soo bandhignay muhiimada goobtan si toos ah ula xiriirinta DARS-AS1, waxaan soo saarnay labadan mutant ee PACT si loo tijaabiyo in haraaga kuwan ay sidoo kale ku lug yeelan karaan isdhexgalka DARS-AS1.Waxa xiiso leh, labada mutantsba waxay lumiyeen awoodda ay ku xidhaan DARS-AS1 (Jaantuska Dheeraadka ah. 4d), oo soo jeedinaya in qaabdhismeedka dhammaystiran ee borotiinka PACT loo baahan karo isdhexgalka hufan ee DARS-AS1.
Intaa waxaa dheer, natiijooyinkayagu waxay sidoo kale soo jeedinayaan in DARS-AS1-shRNA-ku-hortaag ku sameeyay kororka unugyada in qayb ahaan dib loo soo celin karo iyada oo si xad-dhaaf ah loo muujinayo mutant PACT taban (PACTmutA) ama mutant PKR mutant (PKRmut) (Jaantuska Dheeraadka ah. 4e. e).Muujinta xad-dhaafka ah ee mutants-negative PKR waxay hoos u dhigtay fosforyaalka PKR ee ay keentay DARS-AS1 garaacid iyo sidoo kale eIF2a fosforyaalka unugyada serum-ka (Jaantus. 4g).Tan ka sii muhiimsan, saamiga unugyada apoptotic ee ay keentay garaacista DARS-AS1 ayaa sidoo kale hoos loo dhigay unugyada si xad dhaaf ah u muujinaya PKRMut (Jaantus. 4h iyo Sawirka Dheeraadka ah 4g).Joojinta dhaqdhaqaaqa kinase PKR ayaa sidoo kale wax u dhimaya shaqada DARS-AS1, sida natiijooyinku muujiyeen in DARS-AS1 garaacid dhif ah ay kicisay PKR iyo eIF2a fosforyaalka marka unugyada lagu daaweeyay PKR-gaar ah C16 inhibitor (Jaantus. 4i iyo Sawirka Dheeraadka ah 4h).).Isku soo wada duuboo, natiijooyinkayagu waxay soo jeedinayaan in DARS-AS1 ay kor u qaaddo kororka unugyada, ugu yaraan qayb ahaan, iyadoo la joojinayo dhaqdhaqaaqa PKR ee dhexdhexaadinta PACT.
Si loo sii sahamiyo doorka DARS-AS1 ee tumorigenesis, waxaan ku sameynay tijaabooyin vivo iyadoo la adeegsanayo moodalka xenograft mouse. Natiijooyinku waxay muujinayaan in garaacista DARS-AS1 ay si weyn hoos ugu dhacday korriinka burada ee jiirarka (qiimaha p <0.0001) (Jaantus. 5a). Natiijooyinku waxay muujinayaan in garaacista DARS-AS1 ay si weyn hoos ugu dhacday korriinka burada ee jiirarka (qiimaha p <0.0001) (Jaantus. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко Natiijooyinku waxay muujinayaan in garaacista DARS-AS1 ay si aad ah u yarayso koritaanka burada ee jiirarka (qiimaha p <0.0001) (Jaantus 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно Natiijooyinku waxay muujiyeen in garaacista DARS-AS1 ay si weyn hoos ugu dhigtay korriinka buro ee jiirarka (qiimaha p <0.0001) (Jaantuska 5a).Sidaa darteed, kooxda garaacista ee DARS-AS1, waxaa jiray hoos u dhac weyn oo ku yimid mugga burada celceliska qiyaastii 72.9% iyo celceliska tirada burada qiyaastii 87.8% (Jaantus 5b-d).Natiijooyinkani waxay si xoog leh u soo jeedinayaan in DARS-AS1 ay si weyn kor ugu qaadi karto koritaanka burada ee vivo.
Saamaynta xayaysiiska DARS-AS1 garaacista oncogenesis mindhicirka ee jiirarka qaawan.Curyaaminta kobaca (a), cabbirka burada (b), miisaanka (c), iyo sawirada burada (d) ayaa la muujiyay.Baararka khaladku waxay matalaan ±SEM. n = 10. ****p <0.0001, oo leh laba dabo leh t imtixaanka Ardayga. n = 10. ****p <0.0001, oo leh laba dabo leh t imtixaanka Ardayga. n = 10. ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p <0.0001 t-tijaabka Ardayga laba-dabo leh.n = 10. ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p <0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p <0.0001 t-tijaabka Ardayga laba-dabo leh.e Kaplan-Meier waxa uu falanqeeyay xidhiidhka ka dhexeeya heerarka muujinta DARS-AS1 iyo guud ahaan badbaadada bukaanada qaba UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, iyo LGG.Heerarka sare ee DARS-AS1 ee bukaannada ayaa ku jiray 50% ee ugu sarreeya;heerka hoose ee muujinta DARS-AS1 ee bukaanada ayaa ku jiray ugu hooseeya 50%.p-qiimaha ayaa lagu go'aamiyay iyadoo la isticmaalayo imtixaanka darajada log.f Qaabka la soo jeediyay kaas oo DARS-AS1 ay ku maamusho dariiqa PACT-PKR iyo koritaanka burada.
Si loo fahmo saameynta caafimaad ee DARS-AS1, waxaan baarnay xiriirka ka dhexeeya muujintiisa iyo badbaadada bukaanka.Marka la falanqeeyo xogta TCGA, waxaan ogaanay in muujinta sare ee DARS-AS1 ay la xiriirto uveal melanoma (UVM), chromophobia kelyaha (KICH), Kansarka unugyada papillary kelyaha (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex.Badbaadinta hoose ayaa si weyn loola xiriiriyay glioblastoma morphosis (GBM) iyo bukaanada qaba glioma maskaxda heerka hoose (LGG) (Jaantuska 5e).Natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in DARS-AS1 laga yaabo inay door muhiim ah ka ciyaaraan horumarka burooyinka kiliinikada waxayna noqon kartaa biomarker saadaalin kara kansar badan.
Daraasaddan, iyada oo la adeegsanayo baadhis shaqo oo ballaaran oo CRISPRi ah, waxaan go'aaminnay in DARS-AS1 lncRNA ay ka adkaato walbahaarka unugyada kansarka iyadoo la xakameynayo laba jawaab-celiyeyaasha walaaca ee muhiimka ah, PACT iyo PKR.Si toos ah ula falgalka PACT, DARS-AS1 waxay joojisay firfircoonida PKR ee dhexdhexaadinta PACT, taas oo ka hortagaysa dhimashada unugyada apoptotic iyo kor u qaadida kororka unugyada (Jaantus. 5f).Kordhinta DARS-AS1 ayaa lagu arkay noocyo badan oo kansar ah, taasoo soo jeedinaysa in shaqadeeda kor u qaadida badbaadada unugyada kansarka ee xaaladaha walaaca laga yaabo inay si ballaaran u dabaqi karto noocyo badan oo kansar ah.
PACT waxaa loo aqoonsaday borotiinka firfircoonida PKR, iyo firfircoonida PKR ee dhexdhexaadinta PACT waxay door muhiim ah ka ciyaartaa jawaabaha walbahaarka iyadoo nidaaminaysa qoraalka, tarjumaada, apoptosis, iyo hababka kale ee muhiimka ah ee gacanta62.Muddo tobanaan sano ah, ayaa la isku dayay in la fahmo qawaaniinta gaarka ah ee kansarka ee PACT-PKR cascade.Halkan, daraasaddeena ayaa shaaca ka qaaday habab kala duwan oo lagu xakameynayo PACT-PKR ee unugyada kansarka iyada oo loo marayo cellular lncRNA DARS-AS1, taas oo si toos ah ugu xidhan PACT, xannibaysa isdhexgalka PACT-PKR, waxay joojisaa firfircoonida PKR iyo eIF2a phosphorylation, taas oo joojinaysa apoptosis-ka-soo-baxa kicinaysa badinta kansarka ugu danbeyn.unugyo.Helitaankan ayaa iftiiminaya yoolalka lncRNA ee suurtagalka ah ee saadaalinta kansarka iyo daawaynta.
Xogtayadu waxay muujisay in garaacista DARS-AS1 ay dareensiiso unugyada gaajada serum iyadoo ay si weyn u korodhay fosfooraska PKR iyo eIF2a.Natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in DARS-AS1 ay kor u qaaddo badbaadada unugyada kansarka ee xaaladaha adag iyadoo la joojinayo dhaqdhaqaaqa PACT/PKR.Dhowr RNAs kale oo aan codeeyn, sida ASPACT iyo nc886, ayaa sidoo kale ku lug leh dhidibka PACT/PKR iyagoo hoos u dhigaya PACT48 mRNA ama nidaaminaya autophosphorylation iyadoo lagu xirayo PKR49,50,64.Waxaa ka mid ah, DARS-AS1 waxay u shaqeysaa sidii carqalade ururka PACT-PKR.Daraasadani waxay kobcinaysaa fahamkayaga xeerinta dhidibada PACT/PKR iyo doorka lncRNAs ee jawaabaha walaaca.
PACT waxay ka kooban tahay saddex qaybood oo kala duwan.Mid kasta oo ka mid ah labada dsRBD ee ugu horreeya ayaa ku filan si loo gaaro isku xirnaanta sare ee PACT ee PKR, halka qaybta saddexaad (D3) looga baahan yahay firfircoonida PKR gudaha vitro iyo in vivo.Daraasaddeenu waxay muujisay in DARS-AS1 ay doorbidayso inay la falgasho domainka D3 (Jaantus. 3h).Marka la eego cabbirka weyn ee lncRNA (768 nucleotides), DARS-AS1 ku xidhida D3 waxay jir ahaan u joojin kartaa isdhexgalka ka dhexeeya domainka PACT ee dsRBD iyo PKR, taas oo xannibaysa ururka PACT iyo PKR.Isbeddellada dhibcaha PACT ee ku beddelay Ser246 iyo Ser287 ee D3 alanine ama aspartate waxay carqaladeeyeen xidhiidhkii ay u lahaayeen DARS-AS1, iyagoo tilmaamaya muhiimadda D3's guud ahaan dhismaha iyo guryaha korantada ee ururkooda.Faahfaahin dheeraad ah oo ku saabsan habkan ayaa loo baahan doonaa mustaqbalka, iyadoo la adeegsanayo falanqaynta biochemical ee saxda ah iyo xallinta sare ee falanqaynta qaabdhismeedka PACT.
Daraasadihii hore ayaa sheegay in DARS-AS1 ay kor u qaaddo kororka unugyada iyada oo loo marayo dhowr habab51,52,53.Hal tusaale, baarayaashu waxay arkeen in DARS-AS1 ay hagaajisay hiddo-wadaha borotiinka-ka-soo-horjeedka ee DARS iyadoo la beegsanayo miP-194-5p unugyada kansarka kelyaha.Si kastaba ha noqotee, daraasadda hadda jirta, garaacista DARS-AS1 waxay saameyn yar ku yeelatay qorista DARS ee noocyo badan oo kansar ah, oo ay ku jiraan ugu yaraan kansarka mindhicirka, naaska, iyo beerka.Sababtoo ah lncRNAs waxay soo bandhigaan qaababka muujinta unugyada-iyo unugyada gaarka ah, hababka shaqeyntu lagama yaabo in lagu ilaaliyo noocyada kansarka, taas oo gacan ka geysan karta farqiga u dhexeeya indha-indhayntayada iyo qiimayntii hore ee kansarrada kala duwan.Daraasado gaar ah ayaa loo baahan yahay si loo caddeeyo hababka gaarka ah ee hababka nafleyda iyo cudurada kala duwan.
Falanqaynta xogta bukaan-socodka ayaa muujisay in DARS-AS1 muujinta burooyinka ay si aan kala sooc lahayn ula xiriirto badbaadada bukaanka kansarka, taas oo hoosta ka xariiqaysa muhiimada DARS-AS1 / PACT / PKR dhidibka ee saadaasha kansarka.Gebogebadii, daraasaddeenu waxay muujinaysaa in DARS-AS1 ay tahay maamulaha dhidibka calaamadaynta PACT/PKR, waxay kor u qaadaysaa kororka unugyada kansarka, waxayna joojisaa apoptosis inta lagu jiro jawaab-celinta walaaca, taas oo bixisa khad kale oo cilmi-baaris ah oo xiiso u leh cilmi-baarista mustaqbalka ee daaweynta suurtagalka ah. .
Khadadka unugga aadanaha SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 iyo HEK293T ayaa laga helay Kaabayaasha Kheyraadka Khadka Unug ee Qaranka ee Shiinaha.Dhammaan unugyada waxaa lagu ilaaliyay dhexdhexaad DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) oo lagu kabay 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) iyo 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) at 37 ° C, 5% CO2.ilbaxnimo
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Calanka-diidka, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2a (phosphorus S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfooraska S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);jiirka caadiga ah IgG, CST (5415S);bakaylaha caadiga ah IgG, CST (2729S).Unugyada difaaca jirka waxaa lagu qasi jiray 1:1000 gudaha PBST si loogu dhufto Galbeedka iyo 1:100 ee IP.
sgRNAs waxaa la sameeyay iyadoo la adeegsanayo qalab si guud loo heli karo oo la yiraahdo CRISPR-ERA66.Waxaan u isticmaalnay cabbirada aaladaha caadiga ah ee horumarinta sgRNA iyo algoorithm-ka la xisaabiyay goobaha xidhitaanka sgRNA ee gobolka 3 kb.xarunteedu tahay TSS.Barkadaha sgRNA oligonucleotides ayaa lagu farsameeyay CustomArray, Inc.Wadarta 12 µg ee pgRNA plasmid oo bini'aadanti ah, 7.2 µg of psPAX2 (Addgene #12260), iyo 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) ayaa la isu beddelay 5 x 106 HEK293T iyada oo la adeegsanayo saxannada DNA-da ee 10 cm unugyada (CWBIO, Beijing, Shiinaha) raacaya tilmaamaha soo saaraha.Maaddooyinka fayraska ku jira ayaa la ururiyay 48 iyo 72 saacadood ka dib markii la tallaalay waxaana lagu sifeeyay shaandhayn 0.45 µm ah.Baaritaanka, unugyada SW620 ee muujinaya borotiinka isku-dhafka dCas9/KRAB waxaa lagu helay fayraska gudbinta.Unugyada SW620 ee la beddelay ayaa lagu bukooday maktabadda fayraska afar tijaabo oo caabuq ah oo madaxbannaan oo MOI ah 0.1-0.3 waxaana laga qaaday muunad 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) muddo 2 maalmood ah.Intaa ka dib, unugyada waxaa lagu dhaqan geliyay 18 maalmood in vitro iyada oo ugu yaraan daboolitaan maktabadeed 500 unug/sgRNA ah si loo baaro.
DNA-da genomic waxaa la soo saaray iyadoo la raacayo tilmaamaha QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Jarmalka; 51183).Wadar ahaan, 100 μg oo DNA-da genomic ku celis bayooloji ah ayaa loo isticmaalay dhisidda maktabadda.Gobolka sgRNA waxa lagu xoojiyey laba wareeg oo PCR ah waxaana lagu xidhay barcode.
Alaabta PCR waxaa lagu sifeeyay iyadoo la adeegsanayo NucleoSpin® gel iyo xirmada nadiifinta PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Jarmalka; 740609.250) waxaana lagu qiyaasaa iyadoo la adeegsanayo Qubit ™ HS xirmada ogaanshaha DNA-da laba-geesoodka ah (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Imtixaanka MTS waxaa loo isticmaalay in lagu cabbiro kororka unugyada.Unugyada waxaa lagu beeray 96-ceel oo taarikada cufnaanta bilowga ah ee 2000 unug/ceel.Tirada qaraabada ah ee unugyada waxa la qiyaasay maalin kasta wakhtiga la tilmaamay wadar ahaan 4-6 maalmood.Ceel kasta, 20 μl ee MTS reagent (Promega) ayaa lagu qasi jiray 100 μl ee DMEM, oo lagu daray unugyo 4 saacadood oo ah 37 ° C, ka dibna OD490 ayaa la qiyaasay.
Awoodda korriinka aan la xidhin ayaa la ogaaday iyada oo la falanqeeyay samaynta spheres.Si kooban, 2000 unug oo lagu beddelay shRNA DARS-AS1 ama kontoroolka shRNA ayaa lagu dhaqay microplates lifaaqa hooseeya (Corning) oo leh isbeddel dhexdhexaad ah 4tii maalmoodba mar.Spheroids-ka ayaa la tiriyay 14 maalmood ka dib.Unugyada 500 ee lagu beddelay DARS-AS1 plasmid-ka xad-dhaafka ah ama plasmid-ka kantaroolka ayaa loo isticmaalay qiimaynta kobcinta, haddii kale habku isma beddelin.
RNA waxaa lagu qoray iyadoo la adeegsanayo T7 RNA polymerase iyo biotin-16-UTP (Roche 1138908910) sida waafaqsan tilmaamaha Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Furayaasha halkan lagu isticmaalo waxay ku taxan yihiin shaxda Dheeraadka ah 4.
PET15b (Addgene #73619) oo loo beddelay BL21(DE3).Bakteeriyada waxaa lagu dusiyay LB habeenkii oo ay siisay ampicillin ka dibna 100-laab ayaa lagu qasi jiray LB cusub.Marka OD600 ee dhexdhexaadku gaadhay 0.8, 1 mM IPTG ayaa lagu daray si loo kiciyo muujinta borotiinka.Ka dib markii habeenkii si tartiib ah loo ruxruxo (250 rpm at 20°C), pellet-ka unugga waxa lagu soo ururiyay centrifugation (4000 rpm, 10 min, 4°C).Dib ugu celi pellet-ka unugga ee ku jira lysis baffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) oo ku dul bar barafka 30 daqiiqo, ka dibna sonicate (15 min, 5 s on/off, on baraf) iyo centrifuge (13,000) rpm)., 30 min, 4°C).Daawada sare ayaa markaa lagu raray Ni-NTA resin (QIAGEN) 3 jeer 4°C, waxaa lagu maydhay 4 jeer bakhaar lagu dhaqo (50mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) waxaana la soo saaray 3 jeer, wadar ahaan of 10 ml eluent buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).Borotiin la safeeyey ayaa lagu go'aamiyey iyadoo la isticmaalayo WB waxaana xooga saarista lagu go'aamiyey iyadoo la isticmaalayo xirmada qiimaynta borotiinka ee Qubit (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Baaritaannada RIP ayaa la sameeyay sidii hore loo sharraxay, iyadoo wax laga beddelay.Si kooban, 1x RIP buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses cytostatic 1 x cocktail (Roche, 1 mM DTT) iyo centrifuge at 13,000 rpm 15 min at 4 °C.Ka-hortagga ayaa markaa lagu daray borotiinka A+G magnetic beads (Millipore) oo lagu daray 5 μg ee anti-PACT antibody (Abeam) ama IgG (CST).Kuulku waxa lagu maydhay 5 jeer 5x RIP baffer, ka dibna lagu dheefshiiday proteinase K (NEB).RNA waxaa lagu soo saaray Trizol waxaana go'aamiyay RT-qPCR.Aasaaska hore waxa lagu soo bandhigay shaxda kaabista ee 5.
Baaritaanka in vitro ee RIP waxaa loo sameeyay si waafaqsan nidaamka qiimeynta RIP ee la beddelay.Isugeyn 5 pmol oo ah in vitro-ga la turjumay RNA ayaa lagu qasi jiray 1x iyada oo la adeegsanayo RIP baffer waxaana lagu daboolay kulaydh heerkul ah 65°C muddo 5 daqiiqo ah oo ay ku xigto qaboojin tartiib ah ilaa heerkulka qolka.Wadarta 5 pmol ee borotiinnada PACT ee calamada sumaddiisu tahay sax ama beddelan ayaa laga sifeeyay E. coli.Ku dhaji RNA dib loo cusbooneysiiyay 2 saacadood oo ah 4°C oo raac nidaamka kor ku xusan ee falanqaynta RIP ee calan-diidka IP.
Falanqaynta fidinta RNA, 1 × 107 unugyo ayaa lagu dhejiyay 1xRIP kaydiye.Ka dib markii centrifugation at 13,000 rpm 15 min at 4°C, supernatant waxaa lagu sii daaweeyay 30 μl of streptavidin magnetic kuul (Beckman) 2 h at 4 ° C.Lisate-ka la sifeeyay ayaa markaa la keenay tRNA khamiir waxaana lagu daray 40 pmol oo ah RNA dib loo soo celiyay habeenkii 4°C, ka dibna 2 saacadood oo kale iyo 20 μl oo cusub oo streptavidin ah oo kuul magnetic ah oo lagu xannibay BSA ayaa lagu daray.Talabada dhaqida waxay ka koobnayd 4 jeer oo leh 5x RIP baffer iyo 4 jeer oo leh 1x RIP baffer.Barootiinada u dhigma waxaa lagu soo saaray biotin elution buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) waxaana lagu kala soocay NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Ka dib midabaynta qalinka (Beyotime Biotechnology), kooxo gaar ah ayaa laga saaray oo uu falanqeeyay MS.
Falanqaynta Co-IP ayaa la sameeyay si loo tijaabiyo isdhexgalka ka dhexeeya PACT iyo PKR.Si kooban, lysates-ka sarreeya ayaa la diyaariyey iyadoo lagu dhex beeray 1 x 107 unugyo lysed ah oo ku jira 1 x RIP buffer oo ay ku xigto centrifugation at 13,000 rpm 15 daqiiqo at 4°C.Lysates waxaa lagu raray borotiinka A + G birlab magnetic, oo lagu daray 5 µg ee antibody-ka anti-PACT, oo si tartiib ah u wareegay habeenkii 4°C.Kuulaha waxaa lagu maydhay 3 jeer iyadoo leh 5×RIP baffer, laba jeer oo leh 1×RIP baffer waxaana lagu nadiifiyay 1×SDS bakhaar.Borootiinka la helay waxaa falanqeeyay jeelka SDS-PAGE waxaana ogaaday WB.
Laba pmol ee PACT calaman iyo 1 pmol ee PKR ayaa laga sifeeyay E. coli.Ku qas 1 × RIP baffer oo ku dheji 10 pmol oo ah RNA dib loo soo celiyay 2 saacadood at 4 °C.Intaa ka dib, waxaa lagu daray borotiinka A+G magnetic bead-conjugated anti-body antibody laba saacadood oo dheeraad ah.Kuulaha ayaa markaa lagu maydhay afar jeer iyadoo leh 1x RIP buffer waxaana lagu nadiifiyay 1x SDS baffer.Natiijadii PACT iyo PKR waxaa ogaaday WB.